冠狀病毒假病毒系統(tǒng)的構(gòu)建及其在受體識(shí)別中的應(yīng)用.pdf

1、冠狀病毒在自然界中普遍存在且廣泛分布，具有胃腸道、呼吸道及神經(jīng)系統(tǒng)嗜性，可引起嚴(yán)重的消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)疾病。病毒識(shí)別并結(jié)合受體是病毒對(duì)細(xì)胞造成侵染的第一步，同時(shí)也決定著病毒的傳染性和致病力。冠狀病毒通過纖突蛋白(S)與細(xì)胞表面的受體結(jié)合入侵細(xì)胞，弄清病毒蛋白與細(xì)胞受體識(shí)別并結(jié)合的分子機(jī)制是研究開發(fā)抗病毒藥物的基礎(chǔ)。
　　本課題以慢病毒(Lentivirus)和水皰性口炎病毒缺失糖蛋白(VSV-△G)假病毒系統(tǒng)作為工具，通

2、過構(gòu)建不同冠狀病毒纖突蛋白的假病毒分析不同冠狀病毒對(duì)細(xì)胞的感染效率，進(jìn)而研究冠狀病毒的受體識(shí)別機(jī)制。進(jìn)一步通過活病毒感染試驗(yàn)，對(duì)豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）和豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）進(jìn)行了重點(diǎn)研究，期望為深入研究冠狀病毒受體識(shí)別及其入侵細(xì)胞的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。主要包括以下3個(gè)方面內(nèi)容:
　　1.

3、構(gòu)建了VSV-△G假病毒和VSV-△G-S重組假病毒
　　利用水皰性口炎病毒(VSV)的感染性克隆系統(tǒng)，將基因組中的糖蛋白G替換成綠色熒光蛋白(Green fluorescence protein，GFP)，構(gòu)建VSV-△G假病毒。該種假病毒可與其它糖基化蛋白發(fā)生重組，形成具有單一糖蛋白生物學(xué)功能的重組病毒。首先在293T細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)冠狀病毒纖突蛋白(S)，24h后用MOI=3的VSV-△G感染細(xì)胞，24 h后收取VSV-△G-

4、S重組假病毒。將構(gòu)建好的VSV-△G-S假病毒感染不同種屬的細(xì)胞系，分析比較不同冠狀病毒S蛋白介導(dǎo)病毒感染細(xì)胞的效率。結(jié)果表明，與陽(yáng)性對(duì)照VSV-△G-G相比，VSV-△G-S包裝效率較低，因此嘗試?yán)寐《炯俨《鞠到y(tǒng)進(jìn)行研究。
　　2.利用慢病毒假病毒系統(tǒng)研究不同冠狀病毒的細(xì)胞入侵效率
　　慢病毒載體是在HIV-1基礎(chǔ)上改造而成的病毒載體系統(tǒng)。將慢病毒基因組表達(dá)質(zhì)粒(pNL4-3 LucR-E-)與冠狀病毒S蛋白的表達(dá)質(zhì)粒

5、共轉(zhuǎn)至293T細(xì)胞，構(gòu)建假病毒，并感染表達(dá)相應(yīng)受體的細(xì)胞。結(jié)果表明SARS-CoV-S假病毒的感染效率最高;MHV-S和HCoV-229E-S假病毒感染效率次之;TGEV-S和PEDV-S假病毒感染效率較高且相似;HCoV-OC43-S、BCoV-S和IBV-S假病毒對(duì)細(xì)胞的感染效果最弱且存在差異。
　　PEDV-S和TGEV-S假病毒感染豬腎細(xì)胞(PK-15)、人肝臟細(xì)胞（Huh-7）、猴腎細(xì)胞(Vero-CCL-81)和犬腎細(xì)

6、胞(MDCK)，結(jié)果顯示兩種假病毒對(duì)PK-15、Huh-7和Vero-CCL-81細(xì)胞有感染性，對(duì)MDCK不具有感染性。
　　3.PEDV和TGEV細(xì)胞嗜性的研究
　　利用PEDV和TGEV活病毒分別感染PK-15（豬腎細(xì)胞）、Huh-7（人肝臟細(xì)胞）、Vero-CCL-81（猴腎細(xì)胞）和MDCK（犬腎細(xì)胞）4種細(xì)胞系。兩種病毒均以MOI=0.5進(jìn)行感染，同時(shí)加入10μg/mL胰酶促進(jìn)病毒感染，在感染細(xì)胞24h后用間接免疫熒