RNAi靶向BACE1基因治療阿爾茨海默病的實驗研究.pdf

1、實驗?zāi)康?本研究在前期對AD多年研究的基礎(chǔ)之上，采用新的基因表達抑制工具——RNA干擾技術(shù)(RNAinterference，RNAi)技術(shù)，探討RNAi技術(shù)在體外細胞特異性下調(diào)BACE1的效果，為利用RNAi技術(shù)靶向BACE1治療AD研究的進一步開展提供重要資料。 材料與方法 1.采用體外轉(zhuǎn)錄法合成siRNA用于RNAi實驗。體外轉(zhuǎn)錄的基本步驟是：設(shè)計合成T7啟動子(18bp)及含目標基因和T7啟動子反向互補序列

2、的DNA寡核苷酸鏈，兩者退火后形成雙鏈DNA。然后，T7RNA聚合酶在T7啟動子引導(dǎo)下，以目標基因DNA寡核苷酸鏈為模板轉(zhuǎn)錄生成單鏈RNA。用DNase-Ⅰ降解反應(yīng)體系中的DNA，獲得單鏈RNA。將兩個反應(yīng)體系中生成的正、負單鏈RNA退火獲得siRNA。 2.以neuro-2a小鼠神經(jīng)瘤細胞株為實驗對象，將外源GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進neuro-2a細胞，采用不同siRNA劑量對其進行干擾。neuro-2a細胞是一種與原代神經(jīng)元特性相似

3、的細胞，更適合用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究。實驗設(shè)立了空白對照組、陰性對照組、不同劑量siGFP轉(zhuǎn)染組(分別為50ng、150ng、250ng)、非特異性對照組，轉(zhuǎn)染后在熒光顯微鏡下觀察不同實驗組GFP的表達情況。通過觀察GFP的表達與抑制情況檢測合成體外轉(zhuǎn)錄合成siRNA的有效性和特異性，并對neuro-2a細胞的轉(zhuǎn)染特性進行評估，指導(dǎo)對轉(zhuǎn)染體系進行優(yōu)化。 3.采用體外轉(zhuǎn)錄合成的siRNA對neuro-2a細胞內(nèi)源BACE1基因進行

4、干擾。干擾分別從三個不同的位點進行，于干擾后24h、48h、72h提取細胞總RNA，采用realtime-PCR檢測不同干擾位點BACE1mRNA的表達水平。 4.采用AmaxaNucleofectorTM技術(shù)對原代培養(yǎng)的皮質(zhì)神經(jīng)元進行轉(zhuǎn)染，將外源GFP表達質(zhì)粒和干擾GFP的siRNA轉(zhuǎn)染進原代皮質(zhì)神經(jīng)元，成功探索出一種可有效轉(zhuǎn)染原代神經(jīng)元的方法。 結(jié)果 1.通過體外轉(zhuǎn)錄法合成出有效的siRNA。 2.外

5、源GFP質(zhì)粒可被有效的轉(zhuǎn)染進neuro-2a內(nèi)，并有效表達。GFP在細胞內(nèi)的表達呈現(xiàn)一定的時效性，隨轉(zhuǎn)染后時間的延長呈現(xiàn)先逐漸增強然后又逐漸減弱的趨勢，48h～60h時是觀察熒光的較好時機。體外轉(zhuǎn)錄合成的siRNA可以有效的敲低GFP基因的表達，敲低的程度與siRNA的劑量有關(guān)。 3.體外轉(zhuǎn)錄合成的siRNA有效的抑制了neuro-2a細胞內(nèi)源BACE1基因的表達。siRNA對BACE1的抑制效應(yīng)與靶位點的選擇及檢測的時間有關(guān)，

6、不同的干擾位點其抑制效果不同；干擾后選擇不同的檢測時間，檢測到的RNAi抑制效果也不相同。 4.在AmaxaNucleofectorTM轉(zhuǎn)染技術(shù)和轉(zhuǎn)染體系下，原代神經(jīng)元可以被有效轉(zhuǎn)染并表現(xiàn)出明顯的目的基因干擾現(xiàn)象，而且沒有明顯的神經(jīng)毒性反應(yīng) 結(jié)論 1.采用T7RNA聚合酶催化體外轉(zhuǎn)錄法合成siRNA。體外轉(zhuǎn)錄法是一種操作簡單、成本低、效率高的siRNA的合成方法，本課題組在前人的研究之上，對此方法進行了改進，增加

7、了siRNA的提純步驟，祛出了大部分反應(yīng)體系中的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，得到高純度的siRNA，確保了進行RNA干擾研究對細胞或機體對導(dǎo)入siRNA的質(zhì)量要求。這為大范圍、高通量進行RNA干擾研究提供了一種理想的siRNA合成方法。 2.利用體外轉(zhuǎn)錄合成的siRNA，成功抑制了neuro-2a小鼠神經(jīng)瘤細胞株外源GFP基因的表達。將外源GFP基因轉(zhuǎn)染至體外培養(yǎng)的neuro-2a中并使其表達，同時將不同濃度的siGFP共同轉(zhuǎn)染至neuro-

8、2a中，并以siIRR做參照。GFP基因在細胞內(nèi)的表達隨轉(zhuǎn)染后時間的增長呈現(xiàn)出一個先逐漸增高然后又逐漸降低的過程，GFP表達最強的時點為觀察RNAi效果的最佳時刻。對GFP干擾的分析發(fā)現(xiàn)，siRNA不僅能特異、有效地降低外源目標基因的表達，而且隨著siRNA量的增加，其干擾效果越來越明顯。 3.利用體外轉(zhuǎn)錄合成的siRNA，成功抑制了neuro-2a小鼠神經(jīng)瘤細胞株內(nèi)源BACE1基因的表達，這種抑制作用呈現(xiàn)出位點效應(yīng)和時間效應(yīng)。

9、不同的干擾位點，其干擾效果會有不同；另外，siRNA在細胞內(nèi)發(fā)揮靶基因mRNA降解作用需要一定的時間，這主要與siRNA在細胞內(nèi)形成RISC的時間及靶基因mRNA的代謝特性有關(guān)。此外，若一次轉(zhuǎn)染后若停止繼續(xù)添加siRNA，被敲低的靶基因mRNA水平還可逐漸恢復(fù)正常，因此，轉(zhuǎn)染后選擇合適的分析時間至關(guān)重要，過早或過晚分析都會影響對RNAi效果的準確評價。 4.探索出一套可有效轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)皮質(zhì)神經(jīng)元的方法。經(jīng)過一系列實驗探索，發(fā)現(xiàn)通