血管緊張素Ⅱ-Ⅰ型受體單核苷酸多態(tài)與原發(fā)性高血壓的相關(guān)研究.pdf

1、目的： 腎素-血管緊張素系統(tǒng)(Renin-angiotensinsystem,RAS)是體內(nèi)最重要的血壓調(diào)節(jié)系統(tǒng)，血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ,Ang2)Ⅰ型受體(AT1)是腎素-血管緊張素系統(tǒng)重要的組成成分。Ang2主要與AT1受體結(jié)合發(fā)揮收縮血管和調(diào)節(jié)醛固酮分泌的作用，從而調(diào)節(jié)血壓和機體的循環(huán)血量。基因多態(tài)和疾病的連鎖分析是目前研究多基因疾病分子生物學基礎(chǔ)的常用方法。而單核苷酸多態(tài)(singlenucleotide

2、polymorphisms,SNP)是基因組中存在最多的多態(tài)。該研究旨在探討血管緊張素Ⅱ-1型受體基因單核苷酸多態(tài)與原發(fā)性高血壓的相關(guān)性，在分子生物學水平上探討高血壓病的病因。 方法： (1)選取山東地區(qū)原發(fā)性高血壓患者192名(排除糖尿病和高脂血癥患者)為高血壓組。隨機選擇20名高血壓患者做為篩查SNP的樣本。選取192例無高血壓、糖尿病及高血脂血癥的正常人為正常血壓對照組。兩組年齡、體重指數(shù)、空酸血糖、總膽固醇、LD

3、L膽固醇、HDL膽固醇、尿素氮、肌苷均沒有統(tǒng)計學水平的差異(P＞0.05)。高血壓組收縮壓（156±18）mmHg，而對照組為（113±10）mmHg(P＜0.01)，高血壓組舒張壓（97±12）mmHg，而對照組為（74±8）mmHg(P＜0.01)。 (2)DNA提取用常規(guī)酚-氯仿法提取外周血白細胞DNA，用瓊脂糖凝膠電泳測定DNA濃度，并標化濃度值至20ng/ul。 (3)設(shè)計引物在美國國立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫中

4、獲得AT1基因組序列(序列號AF245699)，與其mRNA序列(NM-000685)進行序列對比標出啟動子(promoter)區(qū)、5’非翻譯(5’UTR)區(qū)、內(nèi)含子(Intron)區(qū)、編碼(coding)區(qū)和3’非翻譯(3’UTR)區(qū)。利用Whitehead基因組中心的primer3軟件對調(diào)控區(qū)、外顯子和鄰近外顯子的內(nèi)含子設(shè)計引物進行PCR擴增。 (4)PCR反應(yīng)在96孔板上進行，采用25ul反應(yīng)體系，其中包括人基因組20ng

5、，10×PCR緩沖液2.5ul，25mmol/LMC122ul，10mmol/L，dNTP0.5ul，10umol/L引物0.8ul，5U/uLTaqDNA聚合酶0.2ul，PCR儀為GeneAmp9700PCR儀。PCR反應(yīng)條件為Touchdown程序預(yù)變性95℃2min，94℃變性30S，退火溫度在起始的10個循環(huán)中為63℃-58℃，每次遞減0.5℃，反應(yīng)60S，延伸72℃40S，在以后的30個循環(huán)中，退火溫度固定為58℃，每次反應(yīng)

6、40S，最后延伸7min以終止所有反應(yīng)。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗證。 (5)SNP的發(fā)現(xiàn)和檢測PCR擴增的目的片段經(jīng)樹脂(wizardPCRPrepsDNApurificationresin，Promega)純化后，用ABI-PRISMTMBig-Dye末端標記試劑盒(PE，F(xiàn)osterCity，CA)，以PCR引物為測序引物進行雙向測序反應(yīng)。測序反應(yīng)條件為96℃變性10s，50℃退火5s，60℃延伸4min，35個循環(huán)

7、。產(chǎn)物經(jīng)乙醇沉淀，ABI377DNA測序儀進行熒光標記末端終止法雙向測序，進一步用Polyphred軟件進行序列的判讀和SNP確認。 (6)SNP的基因分型：對具有SNP片段在192個高血壓和192個對照中進行擴增，直接測序，用Polyphred軟件讀出每一個每個樣本的基因型。 (7)統(tǒng)計學分析采用SAS統(tǒng)計學軟件對兩組進行病例對照分析，組間比較采用x2檢驗，P＜0.05認為有統(tǒng)計學差別。 結(jié)果： ATl

8、基因中共檢測出11個SNP，其中G165T和G250T是該研究首次報道，NCBISNP數(shù)據(jù)庫中還沒有收錄。對其中8個頻率大于5％的SNP在192個高血壓病人中和192個正常血壓對照組中進行基因分型，顯示G-52lT多態(tài)(rsl492078)在原發(fā)性高血壓患者中T等位基因的頻率是29.4％，而對照組中T等位基因頻率為21.1％，其分布在兩組中有顯著統(tǒng)計學意義上的差別，P＜0.0l，而以前被廣泛研究的A1166C多態(tài)(rs5186)則沒有顯