質(zhì)粒為載體BMP基因轉(zhuǎn)移促進(jìn)修復(fù)性牙本質(zhì)形成.pdf

1、目的：為增強(qiáng)造牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞在牙齒意外露髓時(shí)形成修復(fù)性牙本質(zhì)的能力、更好的保護(hù)牙髓活力，本研究依據(jù)骨形成蛋白(bonemorphogeneticprotein，BMP)用于促進(jìn)修復(fù)性牙本質(zhì)(reparativedentinogenesis，RD)形成研究和基因轉(zhuǎn)移研究的最新進(jìn)展，以狗牙為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，將編碼骨形成蛋白的基因克隆至真核表達(dá)質(zhì)粒，然后將該質(zhì)粒導(dǎo)植到狗牙齒露髓處，觀察其在局部持續(xù)表達(dá)骨形成蛋白、有效刺激成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的活性、

2、加速RD形成和封閉露髓孔的有效性；評(píng)估其用于臨床的可行性；探索出適應(yīng)范圍更寬、效果更強(qiáng)的保留活髓的治療方法。 由造牙本質(zhì)細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞外基質(zhì)所組成的牙本質(zhì)-牙髓復(fù)合體(Dentine-PulpComplex，DPC)對(duì)于維護(hù)牙髓功能的穩(wěn)定是十分重要的。牙髓組織中含有牙髓干細(xì)胞，其具有分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞的潛能。在原發(fā)性成牙本質(zhì)細(xì)胞(primaryodontoblasts)喪失以后，修復(fù)性牙本質(zhì)可由成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞(odont

3、oblast-likecell)在一定刺激作用下產(chǎn)生；當(dāng)牙髓因受到外傷或牙齒患齲病時(shí)，牙本質(zhì)基質(zhì)所含有的BMP將刺激牙髓干細(xì)胞分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞。臨床研究表明，成年牙髓暴露后，在露髓處可生成RD。 BMP是參與多種組織器官(包括骨和牙齒)發(fā)育形成的多向性信號(hào)分子家族。直接將BMP置于成年的真皮、肌肉、骨、牙髓等組織器官時(shí)，可分別誘導(dǎo)骨或RD的形成。不同的骨形成蛋白在牙本質(zhì)的形成過(guò)程中承擔(dān)不同的任務(wù)。BMP-2是BMP家族中的一員

4、，在牙髓干細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的特定階段發(fā)揮作用。研究表明，結(jié)締組織的修復(fù)是由損傷附近局部的基質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)，所以發(fā)育完成的成年牙髓可能含有能夠?qū)MP信號(hào)起反應(yīng)、產(chǎn)生RD的細(xì)胞。文獻(xiàn)資料顯示，牙髓成纖維細(xì)胞表達(dá)BMP受體BMPR-IA、BMPR-IB、ActR-1、BMPR-II，說(shuō)明牙本質(zhì)的形成與BMP的活動(dòng)相關(guān)。 利用BMP作蓋髓劑可刺激成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化和RD的形成。傳統(tǒng)的蓋髓方法是將骨形成蛋白直接或聯(lián)合載體用于蓋髓，以促

5、進(jìn)成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化及的形成。許多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，外源性重組BMP-2、BMP-4可誘導(dǎo)正常牙髓的形成，提示，如果將這類(lèi)蛋白在臨床上用于意外穿髓的蓋髓治療，有可能會(huì)加速穿髓處的形成、封閉穿髓孔。但是BMP極短的半衰期、需要較高的濃度和絕佳的載體等條件，限制了它的臨床實(shí)際應(yīng)用。近年來(lái)，人們開(kāi)始探索利用基因轉(zhuǎn)移方法促進(jìn)蓋髓劑促進(jìn)的形成?？捎米鬏d體的有病毒載體和非病毒載體，有人報(bào)導(dǎo)利用腺病毒為載體重組BMP2，BMP7，或BMP9的基因轉(zhuǎn)移獲得

6、了成功，基因轉(zhuǎn)移細(xì)胞能夠產(chǎn)生BMPs，繼而促進(jìn)牙髓干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成牙本質(zhì)細(xì)胞，引導(dǎo)的形成，利用病毒為載體，基因能夠得到高水平的表達(dá)。但是由于使用病毒載體所引發(fā)的宿主免疫反應(yīng)極可能因植入而引發(fā)的基因變異限制了病毒作為載體在臨床的應(yīng)用。非病毒載體有很多優(yōu)越性，盡管非病毒載體的基因轉(zhuǎn)移率相對(duì)病毒載體較低，但其制備簡(jiǎn)單，可批量生產(chǎn)。cDNAplasmids生產(chǎn)價(jià)格低廉，能大批量生產(chǎn)，性狀穩(wěn)定可靠，并且純度很高，最大限度地降低了復(fù)制和結(jié)合的風(fēng)險(xiǎn)，以

7、及非常弱的免疫性，可重復(fù)應(yīng)用于免疫活性主體。 方法：將編碼BMP2的cDNA克隆至真核表達(dá)質(zhì)粒，然后將該質(zhì)粒導(dǎo)植到狗牙露髓處，同時(shí)用氫氧化鈣組做對(duì)照。飼養(yǎng)動(dòng)物，然后分別于術(shù)后一周、二周、四周處死動(dòng)物，對(duì)實(shí)驗(yàn)牙進(jìn)行免疫組化分析及組織學(xué)觀察。 結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組BMP2在露髓局部牙髓組織表達(dá)明顯，與氫氧化鈣蓋髓對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組露髓局部牙髓組織形成RD的能力明顯提高。 結(jié)論：質(zhì)粒為載體BMP基因轉(zhuǎn)移作用于促進(jìn)RD形成的方法

8、，不僅可有效增強(qiáng)牙齒露髓時(shí)RD的形成、克服在露髓處單純放置BMP不能為成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞提供足夠刺激的不足；而且還可避免因用重組病毒作為載體可能誘發(fā)牙髓組織免疫損傷的發(fā)生。本研究獲得預(yù)期試驗(yàn)結(jié)果，可為該策略方法的臨床實(shí)際應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。保留牙髓的活力，可維持牙體對(duì)外界環(huán)境變化的反應(yīng)性，同時(shí)也可維持牙體的韌性、避免牙體折裂；對(duì)提高口腔醫(yī)療水平起到較大的促進(jìn)作用。通過(guò)本課題的實(shí)驗(yàn)研究，可證明用真核表達(dá)質(zhì)粒作為BMP基因轉(zhuǎn)移用于可促進(jìn)RD的策略