MKlp2與profilin1對(duì)小鼠卵母細(xì)胞極體排出的調(diào)控作用.pdf

1、哺乳動(dòng)物生命起源的一個(gè)重要基礎(chǔ)的過(guò)程就是卵母細(xì)胞的成熟，這也是多年來(lái)科學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)。卵母細(xì)胞的成熟涉及多個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)過(guò)程，其中，細(xì)胞骨架，包括微管和微絲在內(nèi)，它們的組裝以及動(dòng)態(tài)變化對(duì)于卵母細(xì)胞的成熟極為重要。細(xì)胞骨架任意一部分受到任何的破壞都有可能導(dǎo)致卵母細(xì)胞成熟的失敗或是異常，甚至后續(xù)的受精卵以及胚胎發(fā)育都會(huì)受到影響，進(jìn)而導(dǎo)致嬰兒的缺陷及畸形。然而，涉及到微絲以及微管的調(diào)控機(jī)制，目前的研究還不能完全解釋清楚。因此，進(jìn)一步研究卵母

2、細(xì)胞成熟過(guò)程中的分子調(diào)控機(jī)制，對(duì)于完善人類對(duì)于哺乳動(dòng)物生殖機(jī)理的理解，促進(jìn)家畜繁殖的調(diào)控甚至人類的生殖健康都有著深遠(yuǎn)的意義。
　　本試驗(yàn)以小鼠為研究對(duì)象，采用體外培養(yǎng)、抑制劑處理、嗎啉代(morpholino，MO)注射、活細(xì)胞觀察、免疫熒光染色和激光共聚焦及免疫蛋白印跡等方法，研究相關(guān)分子在小鼠卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中的調(diào)控作用。先用免疫熒光染色法檢測(cè)MKlp2和profilin1兩種蛋白在小鼠卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中的表達(dá)與定位，再分別通

3、過(guò)蛋白特異性抑制劑處理或嗎啉代(morpholino，MO)注射技術(shù)，破壞蛋白的活性或者功能，進(jìn)而研究這兩種蛋白對(duì)于卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中相關(guān)過(guò)程包括紡錘體裝配、染色體排列以及微絲的組裝的影響，最終了解它們對(duì)卵母細(xì)胞極體排出的調(diào)控作用。此外，用蛋白免疫印跡(western blot)技術(shù)，檢測(cè)敲低profilin1后對(duì)微絲以及相關(guān)調(diào)控蛋白表達(dá)的影響，進(jìn)一步揭示profilin1調(diào)控小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟可能的分子機(jī)制，為完善哺乳動(dòng)物卵母細(xì)

4、胞調(diào)控機(jī)制提供重要證據(jù)。本研究共分2個(gè)部分，主要研究結(jié)果如下:
　　試驗(yàn)一、MKlp2蛋白抑制劑paprotrain影響小鼠卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中的極體排出哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂成熟過(guò)程中涉及一系列的重要過(guò)程，包括紡錘體的組裝和遷移，皮質(zhì)重組，以及極體的排出。這些過(guò)程由很多蛋白調(diào)控，但是，MKlp2(有絲分裂類驅(qū)動(dòng)蛋白2;又稱KIF20A)，一個(gè)調(diào)控有絲分裂胞質(zhì)分裂的微管結(jié)合蛋白，是否參與到卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中我們尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)就

5、MKlp2在小鼠卵母細(xì)胞中的功能展開了試驗(yàn)研究，免疫熒光染色結(jié)果顯示，MKlp2定位在卵母細(xì)胞中的微管上;活細(xì)胞觀察發(fā)現(xiàn)用MKlp2的抑制劑破壞MKlp2的活性，導(dǎo)致第一極體排出的失敗，并且能夠在新鮮的培養(yǎng)液中恢復(fù);細(xì)胞周期的分析結(jié)果顯示大多數(shù)卵母細(xì)胞停滯在中期或者末期;但是，經(jīng)過(guò)抑制劑的處理，卵母細(xì)胞的紡錘體結(jié)構(gòu)和染色體的排列并沒(méi)有遭到破壞。因此，本試驗(yàn)證明了MKlp2通過(guò)調(diào)控第一極體排出來(lái)作用于小鼠卵母細(xì)胞的成熟。
　　試驗(yàn)二

6、、Profilin1在小鼠卵母細(xì)胞中微絲介導(dǎo)的極體排出過(guò)程中的反饋調(diào)控作用作為一個(gè)小的微絲綁定蛋白，profilin1在微絲組裝過(guò)程中起著很重要的作用。但是，profilin1在哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞中的功能尚不清楚，為了研究profilin1在卵母細(xì)胞中的功能，我們首先使用了免疫熒光染色來(lái)檢測(cè)profilin1的定位。結(jié)果顯示，profilin1定位在減數(shù)分裂紡錘體的周圍，并且和胞質(zhì)中的微絲共定位。通過(guò)注射特異性的嗎啉代來(lái)敲低profili