5-脂氧化酶與百草枯中毒肺損傷的相關(guān)性研究.pdf

1、目的： 百草枯(paraquat，PQ)1962作為除草劑上市后，在130多個國家廣泛使用，1966年首次報道百草枯中毒致死病例[1]。PQ中毒可引起多臟器損害，肺是其作用的主要靶器官，表現(xiàn)為急性肺泡炎和迅速進(jìn)展的肺間質(zhì)纖維化，是PQ中毒死亡的主要原因。因此百草枯中毒的治療主要集中在減輕肺損傷。百草枯的中毒機(jī)制尚未完全闡明，大量研究證實，以多形核中性粒細(xì)胞(polymorphonuclear neutrophils，PMN)為主

2、的炎性細(xì)胞與多種細(xì)胞因子在其發(fā)病過程中起著重要作用，其中炎性細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失控已逐漸成為國內(nèi)外研究者關(guān)注的焦點，而如何調(diào)控炎性細(xì)胞因子的過度釋放，使細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)恢復(fù)平衡狀態(tài)也已成為研究熱點。白三烯(leukotrienes，LTs)是重要的炎癥介質(zhì)。肺臟是花生四烯酸的主要合成場所，LTs是經(jīng)由5-脂氧化酶(5-lipoxygenase，5-L0)途徑的主要花生四烯酸產(chǎn)物，它由肺泡巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞合成釋放。LTs通過刺激骨髓多功能造血干

3、細(xì)胞以及這些細(xì)胞在血液中的游走而影響白細(xì)胞。白三烯還能增加粘附分子的表達(dá)(故而增強(qiáng)白細(xì)胞對微血管的粘附能力)，促進(jìn)細(xì)胞運動，使其向靶器官組織游移。一旦白細(xì)胞到達(dá)炎癥組織局部，白三烯可增強(qiáng)其生存力和活性。白三烯主要介導(dǎo)中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞的募集[2]。白三烯在肺臟炎癥反應(yīng)中對白細(xì)胞的趨化作用，可能激發(fā)肺臟炎癥反應(yīng)的瀑布效應(yīng)[3]。在Baud等的研究中5-L0的下游產(chǎn)物L(fēng)T對纖維細(xì)胞的遷移，增殖以及基質(zhì)蛋白的增生有直接的作用[

4、4]。外源性給予LTD4可以引起鼠類及人類的纖維細(xì)胞增殖并且這種增殖呈劑量依賴性[5]。研究表明，LTs作為一種重要的前炎癥介質(zhì)，在許多炎性疾病發(fā)病機(jī)制中的重要作用已被逐漸認(rèn)識，但其在PQ中毒發(fā)病過程中的作用尚不清楚。本研究的目的旨在從炎性細(xì)胞的角度探討5-脂氧化酶與PQ中毒肺損傷的相關(guān)性。 材料與方法： 1、動物分組 健康雌性Wistar大白鼠40只，完全隨機(jī)分成對照組和染毒組，染毒組以百草枯50mg/kg體重

5、灌胃染毒，對照組給以等量的生理鹽水。分別于1d，3d，7d，14d處死10只，進(jìn)行支氣管肺泡灌洗液的收集及細(xì)胞測定，應(yīng)用RT-PCR反應(yīng)、免疫組織化學(xué)方法，觀察5-L0在mRNA和蛋白水平的變化。 2、支氣管肺泡灌洗液的測定 采用在體全肺灌洗法收集支氣管肺泡灌洗液，共收集到支氣管肺泡灌洗液約5ml。1500rpm，4℃，離心10min，將離心沉淀的細(xì)胞團(tuán)用0.3ml生理鹽水懸浮，制成細(xì)胞懸液。用全自動血細(xì)胞計數(shù)儀(AC9

6、00型)測定支氣管肺泡灌洗液白細(xì)胞總數(shù)[6]。 3、RNA提取及RT-PCR 用TRIZOL提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA.5-L0基因上游引物5'-CTCCCAGTGACCACAGAA-3'，下游引物5'- ATACCGAACACCTCAGACA-3'，擴(kuò)增片段長496bp，β-actin作為內(nèi)對照(擴(kuò)增片段247bp)。循環(huán)條件：95℃，變性5min，94℃30s-54℃1min-72℃30s，35個循環(huán)，72℃延伸

7、5min。15％瓊脂糖凝膠電泳檢測。 4、免疫組織化學(xué) 肺組織石蠟切片免疫組織化學(xué)方法檢測5-L0蛋白表達(dá)，用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶染色法，按試劑盒說明書操作。 結(jié)果： 1、病理變化 HE染色切片觀察，染毒后1d肺泡結(jié)構(gòu)清晰可見，肺泡腔內(nèi)可見少量炎性細(xì)胞的滲出；染毒后3d肺泡結(jié)構(gòu)可辨認(rèn)，肺泡腔內(nèi)可見大量炎性細(xì)胞的滲出；染毒后7d肺泡結(jié)構(gòu)尚可辨認(rèn)，肺泡腔內(nèi)充滿炎性細(xì)胞的滲出，同時肺泡腔內(nèi)滲出

8、液開始機(jī)化；染毒后14d肺泡結(jié)構(gòu)不清晰，肺泡腔內(nèi)充滿炎性細(xì)胞的滲出，但較前有所減少，可見纖維化樣改變。 2、BALF中WBC總數(shù)的變化 染毒組大鼠BALF中WBC總數(shù)比對照組均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。WBC水平從1d開始增高，7d達(dá)高峰，14d較7d有所減少。 3、5-L0的變化 染毒組大鼠5-L0表達(dá)比對照組均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。5-L0水平從1d開始增強(qiáng)，7d為表達(dá)達(dá)高峰，14d較7d