激光誘導(dǎo)小鼠脈絡(luò)膜新生血管中C9的表達(dá)及CVF干預(yù)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)是引起中老年人低視力和盲的主要原因之一，脈絡(luò)膜新生血管(choroidalneovascularization，CNV)的形成是AMD致盲的首要原因。本課題選擇玻璃膜疣所含成分—補(bǔ)體膜攻擊復(fù)合物(membrane attack complex，MAC)，以激光誘導(dǎo)的小鼠CNV模型，觀察MAC在CNV形成中的表達(dá)及作用，并用補(bǔ)體消

2、耗劑蛇毒因子(cobravenomfactor，CVF)腹腔注射干預(yù)CNV形成。探索補(bǔ)體激活與CNV的關(guān)系，進(jìn)一步闡釋AMD的免疫學(xué)相關(guān)機(jī)制，為CNV的治療提供理論依據(jù)和新方法。 方法： 1.選擇36只C57BL/6J小鼠，6-8周大，體重25-30g，雌雄不限，均經(jīng)直接檢眼鏡、裂隙燈檢查后無(wú)眼部疾病。隨機(jī)分為三組，一組為對(duì)照組(n=12)；二組為CVF干預(yù)組(n=12)：自激光光凝前2天及激光光凝后，每天對(duì)小鼠腹腔注射

3、0.1μg/gCVF；三組為單純激光光凝組(n=12)。 2.CNV模型制造：小鼠腹腔內(nèi)注射10％水合氯醛0.3ml/100g麻醉，復(fù)方托品酰胺散瞳，愛(ài)爾凱因點(diǎn)眼表面麻醉，實(shí)驗(yàn)眼結(jié)膜囊內(nèi)滴適量1％甲基纖維素，眼前放置載玻片作為角膜接觸鏡，能量設(shè)置：氪紅激光(波長(zhǎng)647nm)，光斑直徑50μm，曝光時(shí)間0.1s，輸出功率能量120mw，在后極部打4個(gè)激光斑，距視盤(pán)約2視盤(pán)直徑，光凝后有氣泡產(chǎn)生為擊破Bruch膜的標(biāo)志，直接檢眼鏡觀

4、察眼底激光斑。 3.分別在1、3、5、7天取出眼球，行冰凍切片，利用SABC-FITC免疫熒光染色方法觀察激光區(qū)域染色陽(yáng)性情況，連續(xù)冠狀切片后，每只眼球選取2張激光區(qū)域完整視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)分別行SABC-FITC熒光染色和HE染色，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野(×200倍)，計(jì)數(shù)每個(gè)視野中補(bǔ)體9(complement9，C9)的累積光密度(integratedopticaldensity，IOD)，HE染色光鏡下觀察視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)變化。

5、 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，滿足條件后對(duì)單一處理組或單一時(shí)間點(diǎn)數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，對(duì)不同處理組不同時(shí)間點(diǎn)數(shù)據(jù)采用雙因素方差分析，用SNK法進(jìn)行比較，P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1.HE染色 1組小鼠視網(wǎng)膜為正常視網(wǎng)膜，表現(xiàn)為視網(wǎng)膜各層清晰，內(nèi)外核層排列規(guī)則，視網(wǎng)膜色素上皮層(retinalpigmentepithelium，RPE)，Bruch膜及脈

6、絡(luò)膜結(jié)構(gòu)完整。2組小鼠視網(wǎng)膜光凝后1天光鏡下光凝區(qū)視網(wǎng)膜全層水腫，隆起B(yǎng)ruch膜和RPE層明顯破壞，視網(wǎng)膜內(nèi)、外層結(jié)構(gòu)絮亂，部分缺失。光凝后3天光凝區(qū)視網(wǎng)膜依然水腫，隆起，可見(jiàn)移行增生的RPE細(xì)胞，脈絡(luò)膜毛細(xì)血管充血明顯，內(nèi)皮細(xì)胞增生，未見(jiàn)新生血管形成。光凝后7天光鏡下光斑區(qū)少量CNV形成。視網(wǎng)膜組織有水腫，輕度漿液性脫離，可見(jiàn)視網(wǎng)膜下形成瘢痕灶，瘢痕灶內(nèi)有細(xì)胞排列成不規(guī)則管腔樣結(jié)構(gòu)，損傷部位RPE分解破碎。3組小鼠視網(wǎng)膜光凝后1天光

7、鏡下光凝區(qū)視網(wǎng)膜水腫較2組輕，余基本相同，光凝后3天光凝區(qū)視網(wǎng)膜依然水腫，脈絡(luò)膜毛細(xì)血管充血較2組輕，光凝后7天未見(jiàn)新生血管生成。 2.SABC-FITC組織免疫熒光染色不同處理組和不同時(shí)間點(diǎn)，對(duì)于小鼠C9的SABC-FITC染色的熒光強(qiáng)度表現(xiàn)不盡相同，經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)方差齊，成正態(tài)分布。在不同處理組和不同時(shí)間點(diǎn)經(jīng)雙因素方差分析，小鼠C9的IOD差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)，尚可認(rèn)為各處理組和各時(shí)間點(diǎn)小鼠C9的IOD不同；進(jìn)

8、一步用SNK法行各組兩兩比較，除1，3組之間和B、C組之間小鼠C9的IOD差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外(P=0.990，P=0.999)，其他各組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。在單一處理組條件下，經(jīng)單因素方差分析，除1組，3組小鼠C9的IOD差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外(P=1.000，P=1.000)，其余組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步行SNK法檢驗(yàn)，除2組A，B與C組之間(P=0.993，P=0.924，P=0.917)，小鼠C9的IOD

9、差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其余各組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在單一時(shí)間條件下，經(jīng)單因素方差分析，各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)進(jìn)一步經(jīng)SNK法檢驗(yàn)，除各時(shí)間段*與＃組小鼠C9的IOD差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.995，P=0.983，P=1.000，P=0.977)外，其余各組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論： 本實(shí)驗(yàn)成功建立了激光誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠脈絡(luò)膜新生血管的動(dòng)物模型，通過(guò)視網(wǎng)膜免疫熒光染色