腦組織特異表達(dá)鈣結(jié)合蛋白-D28k轉(zhuǎn)基因小鼠的制備與鑒定.pdf

1、鈣結(jié)合蛋白-D28K(Calbindin D-28k，CaBP-D28k)是鈣結(jié)合蛋白家族重要成員，廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)，能通過與鈣離子、胱天蛋白酶-3、細(xì)胞膜三磷酸腺苷二脂酶和P38等結(jié)合調(diào)控其活性。在帕金森病(Parkinson's disease，PD)患者腦黑質(zhì)致密區(qū)存在少量抗變性能力很強(qiáng)的DA能神經(jīng)元細(xì)胞，其共同特征是胞漿內(nèi)都含CaBP。在遇到缺血和神經(jīng)興奮性毒性時(shí)，CaBP陽性神經(jīng)元細(xì)胞能夠存活，提示CaBP對(duì)神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)

2、作用。細(xì)胞凋亡是包括PD在內(nèi)的許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病中神經(jīng)元細(xì)胞退行性病變的重要方式，而胞內(nèi)鈣離子超載是神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生凋亡的誘因之一。作為一種鈣離子快速緩沖蛋白，CaBP通過與鈣離子結(jié)合對(duì)各種生物化學(xué)信號(hào)發(fā)生反應(yīng)，限制細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度的過度升高，作為酶激活劑激活Ca2+-ATP酶調(diào)節(jié)鈣離子的濃度，通過調(diào)節(jié)離子通道來促進(jìn)鈣離子的擴(kuò)散，在神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)長時(shí)間高強(qiáng)度神經(jīng)活動(dòng)時(shí)保護(hù)細(xì)胞免受鈣超載的損害。增加DA神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)CaBP量可防止其產(chǎn)生退行

3、性病變，達(dá)到治療PD的目的。對(duì)于如何增加DA神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)CaBP的量，目前主要局限于體外細(xì)胞水平和以病毒為載體的體內(nèi)短暫表達(dá)，而CaBP-D28k在DA神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型未見報(bào)道，對(duì)DA神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)機(jī)制還需進(jìn)一步研究。
　　 本研究用腦組織特異酪氨酸羥化酶(Tyrosine hydroxylase，TH)基因啟動(dòng)子構(gòu)建CaBP-D28k表達(dá)載體，用二甲基亞砜(DMSO)處理精子制備轉(zhuǎn)基因小鼠，建立用于PD研究的轉(zhuǎn)基因動(dòng)

4、物模型。首先，根據(jù)發(fā)表的小鼠TH啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)引物，用重疊PCR擴(kuò)增小鼠TH啟動(dòng)子，測序正確后構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pTH-EGFP，用脂質(zhì)體分別轉(zhuǎn)染TH+MN-9D細(xì)胞和TH-ECV細(xì)胞，根據(jù)EGFP報(bào)告基因的表達(dá)與否來驗(yàn)證TH啟動(dòng)子的調(diào)控能力。在此基礎(chǔ)上，用PCR克隆5個(gè)不同的TH啟動(dòng)子基因片段，用相同策略獲得能驅(qū)動(dòng)外源基因在腦組織中特異表達(dá)的TH啟動(dòng)子核心序列。然后，用RT-PCR從小鼠腦組織中擴(kuò)增CaBP-D28k cDNA，將其克隆

5、入含TH啟動(dòng)子的表達(dá)載體，獲得的重組載體pTH-CB經(jīng)脂質(zhì)體包裹后轉(zhuǎn)染MN-9D細(xì)胞，用RT-PCR、免疫沉淀法檢測CaBP-D28k的表達(dá)，用6-羥多巴胺復(fù)制細(xì)胞凋亡模型，用細(xì)胞原位免疫印跡法檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中抗凋亡因子bcl-2的表達(dá)，用Hoechst染色、胱天蛋白酶-3活性檢及鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白Annexin V/PI檢測法，評(píng)價(jià)CaBP的抗細(xì)胞凋亡作用。進(jìn)而將DMSO處理的精子與pTH-CB孵育，將體外受精獲得的胚胎移植小鼠，用W

6、estern blot等試驗(yàn)檢測PCR檢測轉(zhuǎn)基因陽性鼠黑質(zhì)部CaBP-D28k表達(dá)，用MPTP復(fù)制PD模型，通過自主活動(dòng)、游泳實(shí)驗(yàn)、懸掛實(shí)驗(yàn)等研究轉(zhuǎn)基因鼠的行為學(xué)以及黑質(zhì)致密部TH陽性細(xì)胞數(shù)的改變，來驗(yàn)證CaBP的抗MPTP對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷作用。結(jié)果表明，克隆的TH啟動(dòng)子為3650bp，其序列與發(fā)表的TH啟動(dòng)子序列完全一致，能驅(qū)動(dòng)EGFP報(bào)告基因在MN-9D細(xì)胞中表達(dá)。用PCR擴(kuò)增的450bp、1500bp、2000bp、2400bp、

7、3650bp TH啟動(dòng)子序列構(gòu)建報(bào)告載體，其轉(zhuǎn)染的MN-9D細(xì)胞培養(yǎng)中EGFP陽性細(xì)胞的比例無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(分別為8.01％、7.97％、7.85％、7.72％、7.74％)，但在其轉(zhuǎn)染的TH-ECV細(xì)胞培養(yǎng)中，EGFP陽性細(xì)胞比例分別為6.51％、6.35％、6.71％、0.89％、1.02％，3650bp和2400bp啟動(dòng)子在TH-細(xì)胞中的表達(dá)調(diào)控能力受到明顯抑制，初步證明TH啟動(dòng)子中組織特異性調(diào)控元件主要位于2400bp～20

8、00bp區(qū)域。
　　 用RT-PCR從小鼠腦組織中擴(kuò)增的785bp CaBP-D28k cDNA與已報(bào)道的序列完全一致，用TH啟動(dòng)子調(diào)控的CaBP-D28k表達(dá)載體轉(zhuǎn)染MN-9D細(xì)胞，其CaBP-D28k mRNA及蛋白表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，表達(dá)的CaBP能顯著促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)bcl-2表達(dá)，能抑制Caspase-3活性，并能顯著降低細(xì)胞的凋亡數(shù)。
　　 用DMSO處理的精子共獲得96只后代小鼠，其中4只為PCR檢測陽性，2只

9、能穩(wěn)定傳代目的基因，其腦黑質(zhì)部、腹側(cè)被蓋區(qū)的CaBP-D28k表達(dá)量顯著高于正常小鼠，而其海馬、大腦皮層的CaBP-D28k表達(dá)量與正常鼠無明顯差異，初步說明TH啟動(dòng)子能驅(qū)動(dòng)外源CaBP-D28k基因在DA神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)，獲得了腦組織特異表達(dá)CaBP-D28k的轉(zhuǎn)基因小鼠品系。MPTP造模試驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因鼠黑質(zhì)致密部TH陽性細(xì)胞數(shù)和行為學(xué)變化差異不顯著，而正常鼠黑質(zhì)致密部TH陽性細(xì)胞數(shù)和行為學(xué)變化差異顯著，表明腦內(nèi)DA神經(jīng)細(xì)胞中Ca