一、產(chǎn)前應(yīng)用乙肝免疫球蛋白阻斷HBV宮內(nèi)感染療效的系統(tǒng)評價;二、耐藥結(jié)核快速診斷及分子流行病學(xué)研究.pdf

1、第一部分:產(chǎn)前應(yīng)用乙肝免疫球蛋白阻斷HBV宮內(nèi)感染療效的系統(tǒng)評價目的評價HBsAg陽性孕婦孕期免疫接種阻斷HBV宮內(nèi)感染的有效性及安全性。 方法:通過計算機(jī)檢索、手工檢索，全面收集與免疫接種阻斷HBV宮內(nèi)感染有關(guān)的隨機(jī)對照試驗(RCTs)和半隨機(jī)對照試驗(qRCTs)。按照Cochrane協(xié)作網(wǎng)推薦的評價方法對納入研究進(jìn)行方法學(xué)質(zhì)量評價和結(jié)果分析。 結(jié)果:共納入研究10個，包括2168例研究對象。Meta分析結(jié)果主要顯示

2、：HBsAg陽性/HBeAg陽性孕婦(即研究孕婦部分HBsAg單陽，部分HBsAg和HBeAg雙陽)孕期應(yīng)用乙肝免疫球蛋白總劑量600IU宮內(nèi)感染率低于空白組(RR=0.42，95％CI=0.21-0.83，P=0.01)，新生兒HBVDNA陽性率低于空白組(RR=0.30，95％CI=0.10-0.85，P=0.02)，新生兒HBeAg陽性率和新生兒率Anti-HBs陽性率與空白組比較無統(tǒng)計學(xué)差異；總劑量大于600IU時，宮內(nèi)感染率低

3、于空白組(RR=0.39，95％CI=0.26-0.58，P(0.00001)，新生兒率Anti-HBs陽性率與空白組比較無統(tǒng)計學(xué)差異。HBsAg和HBeAg雙陽性孕婦(即研究孕婦HBsAg和HBeAg均為陽性)孕期應(yīng)用乙肝免疫球總劑量大于600IU宮內(nèi)感染率、新生兒HBeAg陽性率、新生兒HBVDNA陽性率、新生兒率Anti-HBs陽性率與空白組比較均無統(tǒng)計學(xué)差異；但總劑量600IU的一個研究報告的新生兒HBeAg陽性率和新生兒HBV

4、DNA陽性率與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)差異。 結(jié)論: Meta分析結(jié)果提示HBsAg陽性/HBeAg陽性孕婦孕期應(yīng)用HBIG產(chǎn)前阻斷HBV宮內(nèi)感染有一定的臨床療效，但由于現(xiàn)有證據(jù)質(zhì)量普遍不高，納入研究存在不同程度的方法學(xué)質(zhì)量缺陷，提示有發(fā)生選擇性偏倚、實施偏倚、測量偏倚的可能性，因此有必要繼續(xù)開展前瞻性、高質(zhì)量、大樣本、多中心的隨機(jī)對照試驗。 第二部分:耐藥結(jié)核快速診斷及分子流行病學(xué)研究研究 目的:應(yīng)用結(jié)核分枝桿菌散在

5、重復(fù)單位(MIRU)分型技術(shù)研究甘肅省定西市和甘南藏族自治州耐藥結(jié)核病的分子流行病學(xué)特征，評估其在結(jié)核病預(yù)防控制方面的應(yīng)用價值；探討變性高效液相色譜(DHPLC)技術(shù)在利福平耐藥結(jié)核分枝桿菌Rpob基因突變檢測中的應(yīng)用價值，建立一種方便快捷的篩查結(jié)核分枝桿菌Rpob基因有無突變的方法。 材料和方法:甘肅省疾病預(yù)防控制中心負(fù)責(zé)監(jiān)測并收集甘肅省定西市和甘南藏族自治州耐藥結(jié)核分枝桿菌和相關(guān)病例資料，共收集菌株90株，對其中75株耐藥菌

6、株進(jìn)行基因分型(15株未復(fù)蘇成功)。收集的所有菌株都采用絕對濃度法在羅氏培養(yǎng)基上進(jìn)行抗結(jié)核藥物敏感性實驗。 采用上海華舜生物工程有限公司基因抽提試劑盒提取分枝桿菌DNA，留出部分DNA稀釋后用于PCR擴(kuò)增，其余DNA保存在-70℃。對MIRU12個位點進(jìn)行分析，使用不同的引物序列分別進(jìn)行擴(kuò)增。12個MIRU位點的等位基因位置、重復(fù)序列大小以及擴(kuò)增引物的合成，參考有關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行。反應(yīng)物質(zhì)包括2×PCR TaqMix10ul，模板DN

7、A 0.5ul(約為5ng)，正反向引物各1ul(10um/l)，7.5ul滅菌雙蒸水，反應(yīng)總體積為20ul。使用MJ PTC-220擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增，所有位點的循環(huán)條件均為：94℃預(yù)變性5min：94℃30sec、58℃ 30sec、72℃1min，共40個循環(huán)；最后72℃延伸7min。擴(kuò)增產(chǎn)物使用含1ug/mlEB的2.5％瓊脂糖膠在1×TAE緩沖液中電泳(4-5V/cm約2.5h)，使用50bp Ladder或100bp Marke

8、r作分子量標(biāo)志，同時以H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株以相同引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作對照。使用凝膠圖像分析系統(tǒng)對電泳結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)合表1根據(jù)各位點擴(kuò)增產(chǎn)物的大小判斷相應(yīng)MIRU位點的拷貝數(shù)。 12個MIRU位點的拷貝數(shù)按順序組成一個12位數(shù)字，稱為該標(biāo)本的MIRU基因型，根據(jù)基因型是否相同，判斷菌株是成簇(Clustered)還是獨特型；采用ntsys-pc軟件(UPGMA法)對結(jié)核分枝桿菌基因型數(shù)字化的結(jié)果進(jìn)行聚類分析；用Microsoft

9、 Excel軟件處理和分析數(shù)據(jù)，計算12個MIRU等位基因的多態(tài)性和MIRU等位基因的分辨率指數(shù)(Hunter-Caston Discrimination Index，HGDI)；結(jié)合流行病學(xué)資料，分析耐藥菌株的流行和傳播特征。 此外，我們應(yīng)用DHPLC技術(shù)對其中的46株菌株進(jìn)行耐藥的快速檢測，首先PCR技術(shù)擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌Rpob基因，而后擴(kuò)增產(chǎn)物與野生型DNA鏈形成異源雙鏈，應(yīng)用DHPLC技術(shù)進(jìn)行分析。DHPLC檢測呈不同峰

10、型的菌株各取一株進(jìn)行基因測序，評價DHPLC技術(shù)的敏感性和特異性。 結(jié)果: 75株耐藥結(jié)核分枝桿菌分離自不同的病人，其中男性51人(68％)，女性24人(32％)，平均年齡38.7歲(范圍16-66歲)，除6人為少數(shù)民族外(5人為芷族，1人為藏族)，其余均為漢族。包含多藥耐藥菌株(至少對利福平和異煙肼同時耐藥)38株。 75株耐藥結(jié)核分枝桿菌共分為36種不同的基因型。成簇菌株數(shù)為50株，成簇率為66.7％，簇的范圍為2-

11、16，最大簇的基因型為223325173533，包含16株菌株；12個MIRU位點中的多態(tài)性有較大差別，位點26顯示了較高的多態(tài)性(h>0.6)，位點31顯示中等程度的多態(tài)性(0.3≤h≤0.6)，其他位點均顯示較低多態(tài)性(h<0.3)；MIRU等位基因的分辨率指數(shù)數(shù)(HGDI)為0.94。 應(yīng)用DHPLC法檢測結(jié)核分枝桿菌時發(fā)現(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)菌株H37RV株和利福平敏感菌株呈現(xiàn)單一尖峰，存在基因突變的耐藥菌株呈現(xiàn)畸形峰形；并且不同基因