LPS對(duì)卵泡顆粒層和膜層細(xì)胞Toll受體基因表達(dá)和類(lèi)固醇激素合成的影響.pdf

1、為研究種鵝等級(jí)卵泡的病原識(shí)別模式受體和內(nèi)分泌功能對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素(LPS)的反應(yīng)性，探討Toll樣受體(TLRs)在種鵝生殖免疫中的作用及其與生殖內(nèi)分泌的關(guān)系，以加深對(duì)生殖系統(tǒng)感染和生殖調(diào)控的理解，尋找有效的治療方法和免疫新靶位，我們以產(chǎn)蛋期揚(yáng)州鵝為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，在種鵝產(chǎn)蛋后8h和2h以及產(chǎn)蛋前4h、16h和28h翅靜脈注射LPS（1.5mg/kg BW），在其產(chǎn)蛋8h后翅靜脈采集血液，并屠宰采集卵巢卵泡，觀察卵泡外觀形態(tài)，分離等級(jí)卵泡的膜層和

2、顆粒層。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)和放射免疫分析法等技術(shù)分別研究種鵝產(chǎn)蛋期卵泡顆粒層(GL)和膜層(TL)的TLRs表達(dá)譜及表達(dá)差異；TLRs在不同生長(zhǎng)期卵泡GL和TL的表達(dá)差異；LPS處理0h，6h，12h，24h和36h后卵泡外觀形態(tài)的變化及GL和TL TLRs的表達(dá)變化，以及血液中孕酮(P4)和雌二醇(E2)的濃度及其合成限速酶基因類(lèi)固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白(StAR)，膽固醇側(cè)鏈裂解酶基因(CYP11A1)，17ɑ

3、-羥化酶和17，20裂解酶基因(CYP17A1)，細(xì)胞色素P450芳香化酶基因(CYP19A1)的表達(dá)變化。
　　結(jié)果顯示，顆粒細(xì)胞中，除了TLR2-2幾乎不表達(dá)，其余所有的TLRs成員，包括TLR1-1，TLR1-2，TLR2-1，TLR3，TLR4，TLR5，TLR7，TLR15和TLR21都表達(dá)；膜細(xì)胞則表達(dá)所有禽類(lèi)TLRs成員。
　　產(chǎn)蛋期種鵝，4個(gè)TLRs家族基因在GL中的表達(dá)水平極顯著高于TL(P<0.01)，3

4、個(gè)TLRs成員在 TL的表達(dá)量極顯著高于 GL(P<0.01)。隨著卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育，各個(gè) TLRs的表達(dá)水平相對(duì)較穩(wěn)定，僅TLR15在GL中的表達(dá)水平隨卵泡發(fā)育而增強(qiáng)(P<0.05)，TLR2-1和TLR15在TL中的表達(dá)水平隨卵泡發(fā)育顯著增強(qiáng)(P<0.05)。
　　LPS處理12小時(shí)內(nèi)，等級(jí)卵泡外觀形態(tài)無(wú)明顯變化，24h時(shí)，部分鵝卵泡出現(xiàn)不規(guī)則的膠凍狀變性，而36h時(shí)，所有實(shí)驗(yàn)鵝卵泡皆出現(xiàn)膠凍狀變性。
　　GL中8個(gè)TLR

5、s家族基因的表達(dá)水平隨LPS作用時(shí)間增加而顯著增強(qiáng)(P<0.01)，而TLR3的表達(dá)水平呈現(xiàn)減弱的趨勢(shì)，這些 TLRs出現(xiàn)差異顯著的時(shí)間點(diǎn)不同。與在GL不同的是，TL中，10個(gè)TLRs家族基因在LPS作用后其表達(dá)水平都逐步增強(qiáng)，并于不同時(shí)間點(diǎn)達(dá)到差異極顯著(P<0.01)。LPS處理后，鵝血液中P4和E2的濃度顯著降低(P<0.01)，都于12h時(shí)達(dá)到差異顯著，而其合成限速酶基因StAR和CYP11A1，CYP17A1和CYP19A1的

6、表達(dá)也減弱，分別于6h，6h，12h和6h時(shí)發(fā)生顯著改變(P<0.01)，其中StAR的表達(dá)水平呈現(xiàn)先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)。
　　綜合上述試驗(yàn)結(jié)果表明，種鵝卵泡中表達(dá)各個(gè)TLRs家族基因，存在TLRs介導(dǎo)的先天性免疫反應(yīng)。顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞對(duì)不同病原微生物的敏感性不同，其潛在的抵御病原微生物的能力也不同。隨著種鵝卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育，顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞的病原識(shí)別能力增強(qiáng)。LPS直接危害卵泡發(fā)育及排卵，所有禽類(lèi)TLRs家族基因的表達(dá)水平都隨之發(fā)生

7、顯著變化，并可分為早期，中期和后期應(yīng)答基因，早期卵泡損傷小，是治療LPS入侵的最佳時(shí)期。此外，LPS還降低P4和E2的合成及其關(guān)鍵限速酶基因的表達(dá)，危害鵝的生殖內(nèi)分泌。
　　基于研究結(jié)果，我們推測(cè)LPS入侵后，卵泡通過(guò)TLRs介導(dǎo)性類(lèi)固醇激素的合成，且這一過(guò)程可能存在時(shí)間依賴(lài)性。本研究對(duì)水禽業(yè)養(yǎng)殖環(huán)境的控制及開(kāi)發(fā)內(nèi)毒素抑制劑、新型減毒疫苗和佐劑可提供參考，對(duì)水禽生殖免疫和生殖內(nèi)分泌，及兩者之間關(guān)系進(jìn)行了初步探討，為其深入研究奠定基