α-(2，3)-(2，6)唾液酸對腫瘤細(xì)胞Cx43間隙連接功能影響的研究.pdf

1、間隙連接通訊(gap junction intercellular communication，GJIC)是以細(xì)胞間的間隙連接(gap junction，GJ)為途徑進(jìn)行的細(xì)胞間直接的信息交流的一種方式，可允許小于1-2kDa的小分子物質(zhì)如金屬離子、第二信使及其它小分子代謝產(chǎn)物通過，使細(xì)胞間可以不通過細(xì)胞外空間而達(dá)到直接通訊的目的。 GJIC與腫瘤密切相關(guān)，多數(shù)腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)為GJIC能力降低或喪失，這是腫瘤細(xì)胞內(nèi)間隙連接異常，

2、導(dǎo)致間隙連接功能障礙所致。間隙連接異常主要表現(xiàn)為連接蛋白(Cx)的異常，其分子機(jī)制可能有以下4個方面：(1)Cx基因突變；(2)Cx mRNA表達(dá)降低或異常表達(dá)；(3)Cx蛋白分布異常(分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)而不是細(xì)胞膜上)；(4)其它蛋白對Cx功能的異常調(diào)節(jié)。 由于間隙連接減少，GJIC水平降低，腫瘤細(xì)胞內(nèi)生長刺激信號超過閥值或生長抑制信號達(dá)不到閥值，因此腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)為過度增生和惡性表型。 細(xì)胞膜表面的糖鏈有三種存在形式，即支

3、鏈中性糖苷、酸性直鏈蛋白聚糖及糖脂，這些糖綴合物通過糖基化影響蛋白質(zhì)功能，在細(xì)胞表面形成分支狀的糖鏈宛如“天線”，傳遞著細(xì)胞間信息，參與細(xì)胞通訊和信號傳遞。細(xì)胞表面糖鏈結(jié)構(gòu)的改變與疾病的發(fā)生、發(fā)展緊密相關(guān)。 腫瘤細(xì)胞表面往往表現(xiàn)糖基異?；?，導(dǎo)致糖鏈異常增多，如出現(xiàn)β(1，6)N-乙酰氨基葡萄糖過度表達(dá)，N-乙酰乳糖胺重復(fù)序列、唾液酸化和巖藻糖化升高等。這些變化可放大細(xì)胞內(nèi)增殖信號，影響細(xì)胞間質(zhì)的粘附、遷移和侵襲特性，導(dǎo)致腫瘤惡性

4、增殖與轉(zhuǎn)移。 一方面腫瘤細(xì)胞間的間隙連接功能異常，一方面腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)多種異常糖鏈，間隙連接與糖鏈在腫瘤中的異常增殖及轉(zhuǎn)移中都起著重要作用，但兩者的聯(lián)系及糖鏈對腫瘤間隙連接功能形成的影響研究的較少。 腫瘤細(xì)胞的一個重要特點(diǎn)之一是細(xì)胞膜表面唾液酸糖鏈含量增加。文獻(xiàn)報道Birgit Rose小組采用衣霉素、苦馬豆堿、粟精胺可以促進(jìn)細(xì)胞間隙連接形成，促進(jìn)細(xì)胞間隙功能增強(qiáng)。衣霉素、苦馬豆堿、粟精胺作用可使細(xì)胞表面產(chǎn)生含有不同單

5、糖組成的糖鏈，進(jìn)而影響唾液酸在糖鏈的末端的形成，考慮到唾液酸在腫瘤中異常高表達(dá)是一種普遍現(xiàn)象，上述研究結(jié)果提示我們可能是腫瘤中細(xì)胞表面的唾液酸殘基影響了腫瘤細(xì)胞的間隙連接功能，從而導(dǎo)致細(xì)胞間隙連接通訊降低，發(fā)生了腫瘤細(xì)胞的惡性增殖及轉(zhuǎn)移。 基于上述假設(shè)，本論文旨在利用多種手段，如分子生物學(xué)手段、激光共聚焦顯微鏡成像技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)，借助于化學(xué)調(diào)節(jié)劑觀察唾液酸改變對細(xì)胞間隙連接功能的影響，在此基礎(chǔ)上觀察唾液酸糖鏈改變前后連接蛋白的

6、表達(dá)、磷酸化水平及細(xì)胞上分布及動態(tài)變化，分析與連接蛋白相互作用的其它蛋白，探討唾液酸對細(xì)胞間隙連接功能影響的機(jī)制。該論文的研究將從一個側(cè)面闡明腫瘤異常糖鏈對腫瘤發(fā)生發(fā)展的影響，為糖生物學(xué)前沿探索性研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 第一部分： α-(2，3)/(2，6)唾液酸對腫瘤細(xì)胞Cx43間隙連接功能的影響 第一章構(gòu)建Hela-Cx43、Hela-Cx43-EGFP穩(wěn)定細(xì)胞株 采用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pBABE，成功構(gòu)建了

7、穩(wěn)定高表達(dá)的Hela-Cx43、Hela-Cx43-EGFP細(xì)胞株，為后續(xù)的研究提供實(shí)驗(yàn)材料。 第二章α-(2，3)/(2，6)唾液酸對腫瘤細(xì)胞Cx43間隙連接功能的影響 1．衣霉素抑制Hela細(xì)胞膜表面N-糖鏈的生成，引起間隙連接功能顯著增強(qiáng)。 2．瞬時干擾Hela細(xì)胞糖基轉(zhuǎn)移酶GnTV，降低細(xì)胞膜表面β1，6分支，促進(jìn)間隙連接功能。 3．唾液酸酶降低Hela細(xì)胞膜表面唾液酸，間隙連接功能顯著增強(qiáng)。

8、 4．唾液酸酶抑制劑增加NIH-3T3細(xì)胞表面唾液酸，間隙連接功能顯著降低。 5、NIH-3T3-STX高表達(dá)α2，8 sialic acid，間隙連接功能無明顯變化。 上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，腫瘤細(xì)胞中唾液酸的高表達(dá)，參與介導(dǎo)了細(xì)胞間隙連接功能的降低，并且這種降低主要與α2，3 sialic acid與α2，6 sialic acid有關(guān)，而與α2，8 sialic acid無關(guān)。上述結(jié)果也說明了腫瘤由于唾液酸的增加促進(jìn)

9、腫瘤發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞間隙連接功能降低有關(guān)。 第二部分： α-(2，3)/(2，6)唾液酸對腫瘤細(xì)胞CX43間隙連接功能影響的機(jī)制研究 1、Westernblotting結(jié)果表明降低細(xì)胞膜表面唾液酸并不改變Cx43的表達(dá)及其磷酸化水平；但Cx43連接斑形成增多； 2、Westernblotting結(jié)果表明唾液酸酶作用后細(xì)胞ZO--1表達(dá)沒有改變，IP及免疫熒光共定位結(jié)果表明唾液酸酶作用后促進(jìn)了Cx43與ZO-

10、1的結(jié)合； 3、Westernblotting結(jié)果表明唾液酸酶作用后細(xì)胞N-cadherin表達(dá)沒有改變，IP及免疫熒光共定位結(jié)果表明唾液酸酶作用后促進(jìn)了Cx43與N-Cadherin復(fù)合物的形成； 4、唾液酸酶作用后細(xì)胞內(nèi)ERK1/2磷酸化水平明顯增加，細(xì)胞間同質(zhì)粘附增加，以及免疫熒光表明唾液酸降低后可促進(jìn)N-cadherin的膜成簇。β-catenin可通過α-catenin介導(dǎo)和細(xì)胞骨架系統(tǒng)(如微管蛋白)相連，IP

11、及免疫熒光共定位結(jié)果發(fā)現(xiàn)唾液酸酶作用后促進(jìn)了細(xì)胞β-catenin與N-cadherin的結(jié)合，IP實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明唾液酸酶作用后Cx43與β-catenin結(jié)合增多； 5、免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明唾液酸酶作用后CX43與微管末端共定位增加； 6、FRAP實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明降低細(xì)胞膜表面唾液酸能加快Cx43連接斑形成； 7、Pull down實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明唾液酸酶作用后N-cadherin分子上唾液酸修飾明顯減少。 上述結(jié)果