漸進(jìn)性咬合紊亂大鼠咬肌損傷及其機(jī)制的初步研究.pdf

1、咀嚼肌功能紊亂是顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病（temporomandibular disorders,TMD）的主要表現(xiàn)之一，包括咀嚼肌的酸脹、疲勞和疼痛等，一般沒有明確的器質(zhì)性肌纖維改變，可能與肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+環(huán)境失調(diào)有關(guān)。本課題組前期實(shí)驗(yàn)顯示，漸進(jìn)性咬合紊亂可以導(dǎo)致Sprague-Dawley（SD）大鼠顳下頜關(guān)節(jié)退行性改變，本研究針對(duì)該動(dòng)物模型中咬肌的顯微、超微結(jié)構(gòu)變化，咬肌內(nèi)線粒體Ca2+含量的變化，肌細(xì)胞損傷敏感蛋白含量變化和血清中肌損傷

2、相關(guān)物質(zhì)含量變化以及這些變化與Ca2+環(huán)境失調(diào)的關(guān)系進(jìn)行研究，以探討漸進(jìn)性咬合紊亂對(duì)大鼠咬肌的影響及其可能的機(jī)制。
　　本實(shí)驗(yàn)采用雌性SD大鼠為研究對(duì)象。首先，采用推左側(cè)上頜、右側(cè)下頜第三磨牙逐漸向遠(yuǎn)中移動(dòng)形成上下頜磨牙尖窩不吻合咬合狀態(tài)，建立雙側(cè)磨牙漸進(jìn)性咬合紊亂模型；然后，觀察大鼠咬肌顯微、超微結(jié)構(gòu)變化，咬肌內(nèi)線粒體Ca2+含量的變化，骨骼肌損傷敏感蛋白表達(dá)變化以及血清中相關(guān)物質(zhì)含量的變化，并觀察鈣離子螯合劑EDTA和鈣通道阻

3、滯劑硝苯地平對(duì)這些變化的影響。
　　第一部分：8周齡雌性SD大鼠42只，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、操作對(duì)照組、咬合紊亂組、咬合紊亂+注射EDTA組、咬合紊亂+注射生理鹽水組、咬合紊亂+注射硝苯地平組、咬合紊亂+注射DMSO組共7個(gè)實(shí)驗(yàn)組，觀察時(shí)間為實(shí)施咬合紊亂后1周、2周、4周共3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的變化。EDTA為鈣離子螯合劑（螯合細(xì)胞內(nèi)的Ca2+），硝苯地平為鈣離子拮抗劑（阻止細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流），兩者均可阻斷細(xì)胞內(nèi)Ca2+的作用。觀察結(jié)果表

4、明，光鏡下各時(shí)間點(diǎn)咬合紊亂組的咬肌與空白對(duì)照組結(jié)構(gòu)大致相同，未見明顯顯微結(jié)構(gòu)異常。透射電子顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)空白對(duì)照組、操作對(duì)照組、咬合紊亂+注射EDTA組、咬合紊亂+注射硝苯地平組的肌纖維結(jié)構(gòu)基本一致，肌原纖維排列整齊，線粒體大小均勻，排列整齊，嵴較多；而咬合紊亂組、咬合紊亂+注射生理鹽水組、咬合紊亂+注射DMSO組肌纖維的部分線粒體變大變圓，基質(zhì)電子密度降低，嵴斷裂變短變少，甚至消失，伴隨線粒體腫脹可見肌漿網(wǎng)空泡化。結(jié)論：漸進(jìn)性咬合紊

5、亂可以導(dǎo)致SD大鼠咬肌輕微的超微結(jié)構(gòu)紊亂，并且這些輕微的超微結(jié)構(gòu)改變可以被鈣離子阻斷劑（EDTA和硝苯地平）抑制。
　　第二部分：8周齡雌性SD大鼠135只，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、操作對(duì)照組、咬合紊亂組、咬合紊亂+注射EDTA組、咬合紊亂+注射生理鹽水組、咬合紊亂+注射硝苯地平組、咬合紊亂+注射DMSO組共7個(gè)實(shí)驗(yàn)組，觀察實(shí)施咬合紊亂后1周、2周、4周共3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的變化。取大鼠咬肌組織用梯度離心法分離其中線粒體后，分別以原子吸收光譜

6、法測(cè)定線粒體內(nèi)Ca2+含量，以BCA法測(cè)定線粒體蛋白含量，以兩者的比值（μg/mg）來(lái)表示咬肌中線粒體Ca2+相對(duì)含量。結(jié)果表明，空白對(duì)照組與操作對(duì)照組、咬合紊亂+注射EDTA組、咬合紊亂+注射硝苯地平組無(wú)明顯差異（P>0.05），而咬合紊亂組與咬合紊亂+注射生理鹽水組、咬合紊亂+注射DMSO組無(wú)無(wú)明顯差異（P>0.05），且均明顯高于操作對(duì)照組（P<0.001）。結(jié)論：漸進(jìn)性咬合紊亂可以導(dǎo)致大鼠咬肌內(nèi)線粒體Ca2+含量明顯增加，而鈣離

7、子阻斷劑（EDTA和硝苯地平）可以阻斷線粒體內(nèi)鈣離子含量升高。
　　第三部分：8周齡雌性SD大鼠36只，隨機(jī)分為操作對(duì)照組、咬合紊亂組、咬合紊亂+注射EDTA組和咬合紊亂+注射硝苯地平組共4個(gè)實(shí)驗(yàn)組，設(shè)立實(shí)施咬合紊亂后1周、2周、4周共3個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)。取大鼠咬肌組織測(cè)定其中骨骼肌損傷敏感蛋白即結(jié)蛋白（desmin）和骨骼肌肌鈣蛋白抑制亞基(skeletal muscle Troponin，sTnI)的含量,以肌動(dòng)蛋白（actin）

8、為內(nèi)參照，分別以積分光密度值desmin/actin和sTnI/actin表示desmin和sTnI的相對(duì)含量，發(fā)現(xiàn)desmin及sTnI在各實(shí)驗(yàn)組間并無(wú)明顯差異（P>0.05）。結(jié)論：漸進(jìn)性咬合紊亂并未造成咬肌中骨骼肌損傷敏感性蛋白（結(jié)蛋白和骨骼肌肌鈣蛋白抑制亞基）的明顯降解。
　　第四部分：8周齡雌性SD大鼠75只，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、咬合紊亂組、咬合紊亂+注射EDTA組、咬合紊亂+注射生理鹽水組共4個(gè)實(shí)驗(yàn)組，設(shè)立實(shí)施咬合紊亂

9、后1周、2周、4周共3個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)。取大鼠血清，分別以全自動(dòng)生化儀檢測(cè)肌酸激酶(creatine kinase，CK)和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)活性，以酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測(cè)肌紅蛋白(myoglobin，Mb)含量。發(fā)現(xiàn)這三種物質(zhì)在各實(shí)驗(yàn)組間無(wú)明顯差異（P>0.05）。結(jié)論：漸進(jìn)性咬合紊亂并未造成血清中肌酸激酶、乳酸