基于深度測(cè)序從全基因組分析母子患者血清HBV準(zhǔn)種多態(tài)性.pdf

1、第一部分基于深度測(cè)序從全基因組分析母子患者血清HBV準(zhǔn)種多態(tài)性
　　目的:通過(guò)建立一種快速、高通量的方法，能夠同時(shí)對(duì)多個(gè)樣本進(jìn)行全基因組深度測(cè)序，對(duì)母子患者血清乙型肝炎病毒(hepatitis Bvirus，HBV)病毒準(zhǔn)種進(jìn)行全基因組重測(cè)序，從病毒全基因組水平上了解不同患者或同一患者體內(nèi)HBV準(zhǔn)種多態(tài)性分布特征，分析母子患者體內(nèi)HBV準(zhǔn)種分布的同源性與差異性，為下一步進(jìn)行疫苗逃逸位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)與鑒定提供依據(jù)。
　　方法:1、制

2、備HBV全基因組序列:以4對(duì)母子患者血清HBV病毒顆粒為模板，PCR擴(kuò)增HBV3.2kb全長(zhǎng)DNA。2、構(gòu)建solexa測(cè)序文庫(kù):(1)使用Nextera Technology將HBV DNA的全基因組片段化，處理成5'端帶轉(zhuǎn)座末端序列的小片段。(2)設(shè)計(jì)Barcode引物，在轉(zhuǎn)座末端序列的5'端加上Barcode序列，通過(guò)PCR給每個(gè)樣本加上標(biāo)簽。(3)膠回收250bp～500bp的目的片段。(4)通過(guò)克隆測(cè)序驗(yàn)證上述構(gòu)建的測(cè)序文庫(kù)。

3、3、將所有樣本等量混合后進(jìn)行兩次solexa測(cè)序。4、對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析:構(gòu)建consensus序列，利用Barcode序列對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分庫(kù)（分庫(kù)標(biāo)準(zhǔn):與barcode序列5'端去掉2個(gè)堿基后的序列完全一致），通過(guò)和consensus序列對(duì)比過(guò)濾低質(zhì)量數(shù)據(jù)（過(guò)濾標(biāo)準(zhǔn):Filtered:Reads N＞3，Poly N＞15，測(cè)序質(zhì)量值＜30; Low P-score:HBV同源性＜90％），通過(guò)分析測(cè)序誤差、coverage

4、分布情況、香農(nóng)熵分布情況等參數(shù)，評(píng)估實(shí)驗(yàn)方法的可行性和重復(fù)性;同時(shí)進(jìn)一步比較采用不同PCR擴(kuò)增方案得到HBV全基因組序列和不同酶濃度處理的HBV全長(zhǎng)序列的測(cè)序數(shù)據(jù)的異同，最后分析了母子患者體內(nèi)病毒準(zhǔn)種的同源性和差異。
　　結(jié)果:1、分庫(kù)，過(guò)濾低質(zhì)量序列后，兩次測(cè)序獲得有用序列的效率分別是30.53％和44.88％，平均每個(gè)位點(diǎn)的測(cè)序深度分別是1043和2733個(gè)堿基。測(cè)序誤差分別是0.26％和0.23％，所有樣本均能夠100％覆蓋

5、HBV全基因組。所有樣本的coverage分布均表現(xiàn)為相同的規(guī)律，在nt900、nt1800和nt2500區(qū)域表現(xiàn)為低覆蓋。每個(gè)樣本兩次測(cè)序在coverage分布的比較上沒(méi)有差別(P＜0.05)，但在香農(nóng)熵的分布比較上，11個(gè)樣本中有3個(gè)樣本兩次測(cè)序有一定差異。2、不同PCR擴(kuò)增方案獲得HBV全長(zhǎng)序列測(cè)序得到的數(shù)據(jù)和不同酶濃度處理的HBV全長(zhǎng)序列測(cè)序后得到的數(shù)據(jù)在coverage分布的比較上沒(méi)有明顯差異(P＜0.05)，但在香農(nóng)熵分布的

6、比較上，第一次測(cè)序有差異，第二次測(cè)序沒(méi)有差異(P＜0.05)。3、母子間準(zhǔn)種序列的相對(duì)香農(nóng)熵分布可以聚類(lèi)，非母子間不能聚類(lèi)。但是母子間序列在S抗原的A決定簇區(qū)域和P、C、X基因的抗原表位的區(qū)域具有差異。
　　結(jié)論:1、結(jié)合Barcode標(biāo)簽，我們建立了一種高通量的對(duì)HBV全基因組進(jìn)行分析的策略方法，有助于深入分析HBV準(zhǔn)種序列特征。
　　2、結(jié)合上述技術(shù)，我們對(duì)臨床乙肝病毒感染的4對(duì)母子樣本進(jìn)行了準(zhǔn)種分析，發(fā)現(xiàn)不同患者和同一

7、患者體內(nèi)HBV準(zhǔn)種分布具有多態(tài)性，并且獲得了患者體內(nèi)HBV準(zhǔn)種的序列在每個(gè)核苷酸位點(diǎn)上的頻譜。
　　3、通過(guò)對(duì)母子患者體內(nèi)HBV準(zhǔn)種全基因組頻譜的聚類(lèi)分析，我們發(fā)現(xiàn)母子患者體內(nèi)的HBV準(zhǔn)種的相似性高，而非母子患者體內(nèi)的HBV準(zhǔn)種的相似性低，從而推測(cè)子代患者體內(nèi)的HBV準(zhǔn)種來(lái)自母親，即HBV的傳播是以垂直傳播為主的。
　　4、分析母子患者體內(nèi)的HBV準(zhǔn)種全基因組頻譜的差異性，我們發(fā)現(xiàn)，這些差異性位點(diǎn)多位于HBV疫苗作用的S抗原

8、的A決定簇區(qū)域或抗原表位區(qū)域，這為下一步對(duì)疫苗逃逸位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)和鑒定提供了依據(jù)。
　　第二部分HBV DNA線(xiàn)性結(jié)構(gòu)與環(huán)化結(jié)構(gòu)在轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞后HBV復(fù)制水平差異的研究
　　目的:通過(guò)比較不同乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）體外復(fù)制體系中分泌的乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)、乙型肝炎病毒e抗原(hepatitis B e antigen，H

9、BeAg)和病毒顆粒的復(fù)制水平，表明采用環(huán)化策略的HBV體外復(fù)制體系更適合HBV反轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子機(jī)制研究。
　　方法:1、選擇已經(jīng)構(gòu)建好的3種質(zhì)粒:(1)由CMV啟動(dòng)的HBV1.1倍體質(zhì)粒(CMV-HBV1.1);(2)由CMV啟動(dòng)的HBV1.3倍體質(zhì)粒(CMV-HBV1.3);(3)由T載體上的啟動(dòng)子啟動(dòng)的HBV1.3倍體質(zhì)粒(T-vector-HBV1.3)。2、任選一個(gè)質(zhì)粒用含有BspQI內(nèi)切酶位點(diǎn)的引物擴(kuò)增HBV全長(zhǎng)（本實(shí)

10、驗(yàn)選擇了CMV-HBV1.1）。使用BspQI限制性?xún)?nèi)切酶酶切，然后用T4 DNA連接酶連接，構(gòu)建環(huán)化HBV DNA（cyclized-HBV）。3、將三種質(zhì)粒和環(huán)化的HBV DNA轉(zhuǎn)染到Huh7細(xì)胞中，5天后收集細(xì)胞上清進(jìn)行ELISA分析，收集細(xì)胞并提取HBV復(fù)制中間體DNA進(jìn)行Southern印跡分析。
　　結(jié)果:1、成功擴(kuò)增HBV全長(zhǎng)片段并構(gòu)建了環(huán)化HBV DNA;2、轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞后，ELISA檢測(cè)乙型肝炎病毒表面抗原(