雜色鮑幼苗“掉板癥”病原及致病機制研究.pdf

1、2001～2006年間，廣東、福建、海南和臺灣沿海養(yǎng)殖的雜色鮑(Haliotisdiversicolor Reeve)在育苗過程中陸續(xù)暴發(fā)大規(guī)模不明原因死亡，主要表現(xiàn)為鮑幼體附著于附著基(波紋板、薄膜等)后第7～20天出現(xiàn)大量死亡，這種鮑苗從附著基上脫落死亡的現(xiàn)象，鮑養(yǎng)殖業(yè)內(nèi)稱之為“掉板癥”或“脫板癥”。我們從育苗環(huán)境的理化因子和生物因子著手，分析病因，排除了環(huán)境理化因子、寄生蟲等的直接影響；超微切片結(jié)果也未發(fā)現(xiàn)病毒粒子。而在對發(fā)病期鮑

2、苗培育環(huán)境中的細菌數(shù)量的分析中發(fā)現(xiàn)，發(fā)病前后細菌數(shù)量有顯著變化，推測鮑幼苗的發(fā)病跟細菌有關(guān)系。通過分離純化，從病鮑體內(nèi)獲得了一株毒力很強的病原菌，命名為菌株NA0301，菌株NA0301的48 hr半致死濃度LD50=2.25×106 CFU/mL。經(jīng)生理生化特性鑒定和16S rDNA、rpoA基因等分子標記的序列分析，最終鑒定病原菌株NA0301為溶珊瑚弧菌(Vibrio corallilyticus)?；貧w感染試驗結(jié)果確認溶珊瑚弧菌

3、NA0301是雜色鮑幼苗“掉板癥”的主要致病菌之一。
　　 rpo A基因是一個看家基因，在同一弧菌屬不同種間的變異度在一般在88％～98％間，相似度小于88％一般屬于不同屬的菌株。本研究據(jù)此建立了一套可行的弧菌鑒定方法。本研究除了應用分析rpo A基因來鑒定弧菌外，在菌株NA0301的rpo A基因序列分析的基礎上設計并合成了一套環(huán)介導等溫擴增(LAMP)特異性強的引物，成功建立了對溶珊瑚弧菌LAMP檢測方法，檢測特異性強，與

4、多種其他病原弧菌、腸道菌以及環(huán)境菌均未出現(xiàn)交叉反應，檢測靈敏度高，基因組DNA的最低檢測限小于66fg；細菌純培養(yǎng)物檢測限為36 CFU/mL。
　　 溶珊瑚弧菌NA0301的胞外產(chǎn)物具有強的生理活性，具有蛋白酶活性、溶血活性和淀粉酶活性。其中，在鹽度為2.6％，pH為10.0，溫度為28℃的培養(yǎng)條件下溶血活性最強。分析了胞外產(chǎn)物在不同條件下的酶活力穩(wěn)定性，胞外產(chǎn)物在煮沸10min或60℃溫浴1 hr的實驗條件下，均可同時失去溶

5、血酶、淀粉酶、蛋白酶活性；37℃水浴2 hr以上酶活性下降。菌株NA0301能分泌鐵載體，該鐵載體對鐵離子的絡合力介于鎘天青和8-羥基喹啉之間。胞外產(chǎn)物對鮑具有毒性，能在48hr內(nèi)致使實驗鮑死亡。胞外產(chǎn)物和洗滌后的菌體的毒性試驗結(jié)果比較表明，胞外產(chǎn)物在菌株NA0301對鮑的致病過程中起著重要作用。組織病理學和免疫組織化學研究結(jié)果顯示，病原菌入侵鮑體后，主要靶器官為肝組織、唾液腺、外套膜；4hr后即可在肝組織、唾液腺、外套膜等組織中發(fā)現(xiàn)病

6、原弧菌NA0301。病鮑的鰓絲、肝組織、肌絲、消化腺等有不同程度的受損，各組織中出現(xiàn)空泡化，呈現(xiàn)明顯的病理損傷特征。鮑在注射感染了菌株NA0301后，部分免疫因子呈現(xiàn)出一定的變化規(guī)律，在注射感染病原菌的第1、2 hr，AKP和ACP酶活力均比對照組低，當注射感染后第6～48 hr，AKP和ACP酶活力均大幅上升，明顯高于對照組。SOD和POD活力在注射2hr內(nèi)和注射后8hr以后，活力水平均明顯低于對照組。這4種主要免疫因子的酶活力變化表

7、明雜色鮑的血淋巴在病原菌NA0301開始入侵體內(nèi)時即發(fā)揮了重要的作用，伴隨著釋放出大量與免疫清除相關(guān)的水解酶ACP、AKP、POD、SOD等，可以通過測定鮑血清中ACP、AKP等部分免疫因子來推算鮑的非特異性免疫水平。本研究初步闡明了溶珊瑚弧菌對鮑的致病機制以及感染病原菌后鮑的部分免疫因子變化規(guī)律。
　　 藥物敏感實驗結(jié)果表明，溶珊瑚弧菌NA0301對利福平、氯霉素和環(huán)丙沙星等高度敏感，對萬古霉素、克林霉素等有強耐藥抗性。中草藥