雜色鮑高溫和缺氧應激下若干熱激反應基因的研究.pdf

1、熱激反應相關基因對機體在高溫及缺氧應激條件下啟動熱休克反應具有重要作用。本研究通過簡并引物擴增、轉錄組數(shù)據(jù)庫查找并結合SMART-RACE技術成功克隆得到5條熱休克及免疫調控相關基因：熱休克轉錄因子1（heat shock transcriptional factor1，HSF1）、熱休克因子結合蛋白1（heat shock factor binding protein1，HSBP1）、熱休克蛋白90（heat shock protei

2、n90，HSP90）、同種移植炎癥因子1（allograft inflammatory factor1, AIF-1）和紫色酸性磷酸酯酶（Purple acid phosphatase, PAP），并分別命名為HdHSF1、HdHSBP1、HdHSP90、HdAIF-1和HdPAP。采用實時熒光定量 PCR（qPCR）技術分析雜色鮑若干熱激反應基因在高溫和缺氧應激過程中的變化。通過培養(yǎng)雜色鮑血細胞，運用RNAi技術對HdHSF1干擾后，

3、檢測其它熱休克相關基因的表達情況并作分析。主要的研究結果如下：（1）HdHSF1的cDNA全長為2134 bp，編碼515個氨基酸。qRT-PCR顯示HdHSF1在鰓中表達量最高，在血淋巴中表達量最低。HdHSF1在高溫應激后的96 h和192 h的鰓組織中表達量顯著上調，而在血淋巴中則當溫度升至28℃及31℃下0 h和192 h均出現(xiàn)表達量顯著性上調（p<0.05）。同時，在缺氧應激下，鰓中HdHSF1在缺氧4 h、24 h和96 h

4、均出現(xiàn)顯著性上調表達，而在血淋巴中直到96 h才出現(xiàn)表達量顯著性上調。高溫和缺氧聯(lián)合應激情況下，鰓中HdHSF1的表達量在暴露4 h、24 h和96 h均顯著高于對照組，而血淋巴中則是在應激的0 h時實驗組 HdHSF1的表達量顯著高于對照組。通過 RNAi技術對HdHSF1進行表達抑制，實驗組HdHSF1的表達量顯著低于空白對照組和陰性對照組。
　?。?）HdHSBP1的cDNA全序列為809 bp，編碼75個氨基酸。HdHSB

5、P1在血淋巴中的表達量最高。自熱應激初始階段血淋巴中該基因的表達量就出現(xiàn)顯著性下調（p<0.05）。而鰓中HdHSBP1的表達量在熱應激后也出現(xiàn)顯著性下調，到24 h則恢復到對照組水平，96 h和192 h該基因的表達量均顯著低于對照組水平。此外，在血淋巴中所有熱應激時相的HdHSBP1的表達量均顯著低于對照組。缺氧應激條件下鰓中HdHSBP1的表達量自24 h到192 h均顯著低于對照組（p<0.05）。高溫和缺氧聯(lián)合應激情況下，Hd

6、HSBP1在暴露4 h時的鰓中表達量顯著高于對照組。而在血淋巴中，0 h時實驗組顯著低于對照組，到了4 h時 HdHSBP1的表達量又顯著性高于對照組。在 HdHSF1的表達受抑制情況下，實驗組HdHSBP1的表達量顯著低于空白對照組與陰性對照組。
　　（3）HdHSP90的cDNA全長2592 bp，編碼728氨基酸。HdHSP90在消化道和粘液腺中表達量最高。當溫度升至28℃及31℃應激下0 h和192 h，HdHSP90在鰓

7、中的表達量顯著上調，在血淋巴中則在31℃下0 h和4 h出現(xiàn)顯著上調表達（p<0.05）。缺氧應激下，鰓中HdHSP90表達量則在4 h、24 h和96 h顯著上調表達，血淋巴中到192 h出現(xiàn)顯著上調表達（p<0.05）。高溫和缺氧聯(lián)合應激情況下，鰓中HdHSP90在應激4 h時實驗組顯著高于對照組（p<0.05），血淋巴中無顯著性差異。在HdHSF1的表達受抑制情況下，實驗組HdHSP90的表達量顯著低于空白對照和陰性對照。

8、　?。?）HdAIF-1的cDNA全長942 bp，編碼151個氨基酸。HdAIF-1基因在所檢測的7個組織均有表達，其中在血淋巴中的表達量最高。高溫應激下，雜色鮑鰓中HdAIF-1的表達量顯著上調（p<0.05），并在溫度升至31℃時表達量達到最高。在96 h時，血淋巴和肝胰腺中的表達量顯著高于對照組（p<0.05），血淋巴在192 h時仍顯著高于對照組（p<0.05）。缺氧應激24 h，HdAIF-1在鰓中表達量顯著下調（p<0.0

9、5），96 h恢復到正常水平，到了192 h，缺氧組的HdAIF-1表達量又顯著上升（p<0.05）。
　?。?）HdPAP cDNA全長1215 bp，編碼322個氨基酸。qRT-PCR顯示，HdPAP在檢測的雜色鮑各組織中均有表達，其中在血淋巴和肝胰腺的表達量顯著高于其他各組織。高溫應激下，HdPAP在血淋巴、肝胰腺和鰓中均出現(xiàn)不同程度的表達抑制。缺氧應激4 h血淋巴中HdPAP顯著低于對照組，24 h恢復到正常水平，96 h

10、顯著高于對照組，到192 h又恢復到正常水平。
　　從轉錄組數(shù)據(jù)庫中篩選獲得雜色鮑熱休克相關蛋白：熱休克蛋白22（Heat shock protein22, HSP22）、熱休克蛋白26（Heat shock protein26, HSP26）、熱休克蛋白40（Heat shock protein40, HSP40）、熱休克蛋白60（Heat shock protein60, HSP60）、熱休克蛋白70（Heat shock p

11、rotein70, HSP70）、熱休克蛋白105（Heat shock protein105, HSP105）和熱激誘導磷酸化因子1（Stress induced-phosphoprotein1, Sip1），依次命名為HdHSP22、HdHSP26、HdHSP40、HdHSP60、HdHSP70、HdHSP105和HdSip1。高溫、缺氧以及高溫和缺氧聯(lián)合應激情況下，雜色鮑鰓中上述基因表達量也出現(xiàn)了不同程度的表達上調情況。在對HdH