頜下腺細(xì)胞與緩釋EGF的殼聚糖溫敏凝膠復(fù)合培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　探討具有表皮生長(zhǎng)因子(EGF)緩釋性能的殼聚糖溫敏凝膠用于頜下腺組織工程的可行性與優(yōu)越性。
　　方法：
　　體外采用組織塊法原代培養(yǎng)7d齡的SD大鼠頜下腺細(xì)胞(RSMG Cells)，免疫熒光法鑒定細(xì)胞來源，并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代、純化。
　　通過殼聚糖（Chitosan，CS）與β-甘油磷酸鈉（β-glycerophosphate，β-GP）發(fā)生中和以制備殼聚糖溫敏凝膠，觀察其一般特性，掃描電鏡下觀察超微

2、結(jié)構(gòu)，分別以三種不同終濃度檢測(cè)其對(duì)EGF緩釋性能，繪制釋放曲線。取第二代生長(zhǎng)良好的大鼠頜下腺細(xì)胞，以2×104/mL的細(xì)胞密度將負(fù)載EGF的殼聚糖溫敏凝膠、游離EGF培養(yǎng)基、殼聚糖溫敏凝膠以及單純含10％胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)基分別作為EGF凝膠組、游離EGF組、單純凝膠組及空白組，與大鼠頜下腺細(xì)胞進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)。經(jīng)MTT法和碘-淀粉酶比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況、分泌功能。利用SPSS13.0軟件，分別按照濃度和時(shí)間因素分組，作單因素多

3、水平兩兩比較方差分析(Student-Newman-Keuls，S-N-K)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。利用吖啶橙(AO)免疫熒光染色與激光共聚焦顯微鏡觀察復(fù)合培養(yǎng)后細(xì)胞活性。
　　結(jié)果：
　　室溫下，殼聚糖溫敏凝膠溶液表現(xiàn)為透明液狀，流動(dòng)性良好;PH值約為7.1。置于37℃恒溫水浴箱約10-12min后可形成凝膠，顏色乳白，倒置后不發(fā)生流動(dòng)，且凝膠形態(tài)良好。掃描電鏡觀察殼聚糖溫敏凝膠，其形態(tài)呈現(xiàn)為疏松

4、、多孔狀結(jié)構(gòu)。釋藥初期殼聚糖溫敏凝膠釋放速度較快，體現(xiàn)出突釋性，3d后釋放速度逐漸趨于平穩(wěn)，且EGF的累積釋放率隨殼聚糖溫敏凝膠所負(fù)載EGF濃度的增加而不斷增大。在促進(jìn)細(xì)胞增殖方面，單純凝膠組與空白組相比較無顯著性差異(P＞0.05)，EGF凝膠組、游離EGF組與單純凝膠組相比較，對(duì)大鼠SMGCs增殖均表現(xiàn)出明顯促進(jìn)作用(P＜0.01)，EGF凝膠組、游離EGF組各濃度水平的組內(nèi)比較有顯著性差異(P＜0.01);EGF凝膠組各濃度水平對(duì)

5、大鼠SMGCs增殖表現(xiàn)出具有濃度依賴性的促進(jìn)作用。當(dāng)EGF凝膠組和游離EGF組均選取20μg/L作為EGF添加濃度時(shí)，二者對(duì)大鼠SMGCs增殖的促進(jìn)作用呈時(shí)間依賴性，1～3d內(nèi)游離EGF組的促進(jìn)作用明顯(P＜0.01)，自第5天起EGF凝膠組的促進(jìn)作用明顯(P＜0.01)。隨著復(fù)合培養(yǎng)時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，經(jīng)四種方法培養(yǎng)的大鼠SMGCs，其上清液淀粉酶分泌量均表現(xiàn)出不同程度的增加，其變化呈現(xiàn)與細(xì)胞增殖類似的趨勢(shì)。吖啶橙(AO)免疫熒光染色與激