CYP1A1共轉(zhuǎn)染報(bào)告基因模型的建立及在中藥單體影響CYP1A1基因表達(dá)篩選的應(yīng)用.pdf

1、CYP1A1是CYP450的一種亞型，其轉(zhuǎn)染活化受到芳香烴受體(AhR)的調(diào)控。CYP1A1可氧化代謝多環(huán)芳香類化合物(PAHs)，將其代謝為具有基因毒性的一系列的水溶性衍生物，這些衍生物可以接合到DNA結(jié)構(gòu)中，影響DNA的正常功能，從而誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生。這類化合物中的TCDD(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p dioxin)是目前所知CYP1A1最強(qiáng)的誘導(dǎo)劑。
　　 臨床上，CYP1A1的活化會(huì)導(dǎo)致許多不

2、期望發(fā)生的藥物相互作用和毒副反應(yīng)。因而人們?yōu)榱祟A(yù)測(cè)和控制CYP1A1的活性，開發(fā)了許多方法用以檢測(cè)CYP1A1在外源化合物作用下的活性，并用以發(fā)現(xiàn)CYP1A1的專屬誘導(dǎo)劑或抑制劑。熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)就是這些方法較為先進(jìn)的一種。其基本原理是將一段需要檢測(cè)的基因的調(diào)控序列與表達(dá)螢火蟲熒光素酶的基因序列接合到一起，然后將這段接合的DNA以質(zhì)粒的形式導(dǎo)入到細(xì)胞中，目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄活性就會(huì)以螢火蟲熒光素酶的多少表達(dá)出來。報(bào)告基因模型相比經(jīng)典的方法

3、具有無可替代的優(yōu)勢(shì)，具有很高的普及性和應(yīng)用性。
　　 因此，本研究的目的是建立和驗(yàn)證CYP1A1熒光素酶報(bào)告基因模型，并應(yīng)用于篩選常見中藥，如銀杏，丹參，大黃，白花前胡，紫菀等的有效成分對(duì)CYP1A1酶基因表達(dá)的影響，為研究及預(yù)測(cè)藥物相互作用提供依據(jù)。
　　 一、人CYP1A1報(bào)告基因模型的建立和驗(yàn)證。
　　 目的：建立人CYP1A1報(bào)告基因模型，為下一步藥物誘導(dǎo)及抑制實(shí)驗(yàn)提供基礎(chǔ)。
　　 方法：采用由德

4、國Tubingen大學(xué)Peter A.Munzel教授構(gòu)建的三種質(zhì)粒，分別為pT81Luc/hCYP1A1-5_wt，pT81/CDEF及pT81/hCYP1a1_3×DRE。并選擇來源于人肝的HepG2細(xì)胞和來源于人小腸的LS174T細(xì)胞做為其載體。應(yīng)用脂質(zhì)體Lipofectamine2000將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞。
　　 結(jié)果：
　　 1.通過確定細(xì)胞的接種量，脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染比例，最終確定采用質(zhì)粒pT81/hCYP1a1_3×

5、DRE建立報(bào)告基因模型。
　　 2.采用TCDD做陽性對(duì)照，通過篩選不同濃度，最終選用10nM做高通量篩選時(shí)的陽性對(duì)照的濃度。
　　 結(jié)論：本部分采取簡(jiǎn)單易行而且高效的方法，通過選擇合適的質(zhì)粒，考查并優(yōu)化多項(xiàng)指標(biāo)，成功地在HepG2細(xì)胞及LS174T細(xì)胞上建立了人CYP1A1報(bào)告基因模型。并確定了陽性藥物TCDD進(jìn)行藥物誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)的最佳濃度，為下一步的篩選實(shí)驗(yàn)提供了可靠的基礎(chǔ)。
　　 二、銀杏葉提取物及其它中藥單體

6、誘導(dǎo)人CYP1A1基因表達(dá)的研究。
　　 目的：篩選包括銀杏葉提取物，丹參，大黃，前胡，桑白皮，紫苑等常見中藥中的單體化合物對(duì)CYP1A1基因基礎(chǔ)表達(dá)的誘導(dǎo)情況。
　　 方法：采用之前建立的人CYP1A1報(bào)告基因模型，在24孔板或48孔板上接種HepG2細(xì)胞或LS174T細(xì)胞，12h之后轉(zhuǎn)染pT81/hCYP1a1_3×DRE進(jìn)細(xì)胞，4-6h后按所需的濃度加入待測(cè)藥物。孵育48h之后通過報(bào)告基因檢測(cè)基因表達(dá)。
　　

7、 結(jié)果：
　　 1.銀杏葉提取物中的三種萜類化合物銀杏內(nèi)酯A(GA)，銀杏內(nèi)酯B(GB)及白果內(nèi)酯(BB)在基于HepG2細(xì)胞的模型上，與空白對(duì)照組比均可抑制CYP1A1的轉(zhuǎn)錄活性。三種主要的黃酮類化合物槲皮素(Que)，山萘酚(Kae)，異鼠李素(Iso)則誘導(dǎo)CYP1A1的轉(zhuǎn)錄活性。而在基于LS174T細(xì)胞的模型上，除銀杏內(nèi)酯B(GB)外均可抑制CYP1A1的轉(zhuǎn)錄活性。
　　 2.丹參中的六種有效成分丹參酮Ⅰ(Ta

8、nⅠ)，丹參素鈉(SD)，原兒茶醛(Proto)，丹酚酸B(SA-B)，丹參酮ⅡA(TanⅡA)，隱丹參酮(CTan)在基于HepG2細(xì)胞的模型上，與空白對(duì)照組比均可誘導(dǎo)CYP1A1的轉(zhuǎn)錄活性。而在基于LS174T細(xì)胞的模型上，均可抑制CYP1A1的轉(zhuǎn)錄活性。
　　 3.大黃中的大黃素甲醚(Phy)，大黃酸(Rhe)，大黃酚(Chr)在基于HepG2細(xì)胞的模型上，均可誘導(dǎo)CYP1A1的轉(zhuǎn)錄活性。大黃素(Emo)和蘆薈大黃素(Al

9、o)則可抑制CYP1A1的轉(zhuǎn)錄活性。而在基于LS174T細(xì)胞的模型上，則均可抑制CYP1A1的轉(zhuǎn)錄活性。
　　 4.白花前胡中的四種有效成分在基于HepG2細(xì)胞的模型上，除白花前胡素E(PraE)外，白花前胡甲素(PraA)，白花前胡丙素(PraC)，白花前胡丁素(PraD)均可誘導(dǎo)CYP1A1的轉(zhuǎn)錄活性。而在基于LS174T細(xì)胞的模型上，除白花前胡甲素(PraA)外均可抑制CYP1A1的轉(zhuǎn)錄活性。
　　 5.紫苑中的兩

10、種有效成分紫苑酮(Shi)和表木栓醇(Epi)，以及桑色素(Mor)，桑皮苷A(Mul)，白藜蘆醇(Resveratrol)在基于HepG2細(xì)胞的模型上，除桑皮苷A(Mul)外均可誘導(dǎo)CYP1A1的轉(zhuǎn)錄活性。而在基于LS174T細(xì)胞的模型上，除桑色素(Mor)外均可抑制CYP1A1的轉(zhuǎn)錄活性。
　　 6.白藜蘆醇(Resveratrol)在給予梯度濃度0.01μM，0.1μM，1μM，10μM，100μM的情況下，除0.01μM

11、，0.1μM兩個(gè)給藥組產(chǎn)生了抑制作用，其它三個(gè)給藥組1μM，10μM，100μM都產(chǎn)生了誘導(dǎo)作用，且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。
　　 結(jié)論：本部分研究通過之前建立的人CYP1A1報(bào)告基因模型，篩選了包括銀杏葉提取物，丹參，大黃，白花前胡，紫苑等常見中藥中的主要單體，以及桑皮苷A，桑色素，白藜蘆醇等，總共25個(gè)中藥單體化合物。結(jié)果表明這些化合物普遍存在誘導(dǎo)或抑制人CYP1A1基因表達(dá)的作用。其中誘導(dǎo)作用中較為顯著的結(jié)果有白藜蘆醇(Re

12、sveratrol)使轉(zhuǎn)錄活性升高到3.60倍。對(duì)白藜蘆醇不同濃度的篩選表明白其誘導(dǎo)作用呈現(xiàn)劑量依賴性。
　　 三、銀杏葉提取物及其它中藥單體抑制人CYP1A1基因表達(dá)的研究。
　　 目的：在CYP1A1基因處于誘導(dǎo)高表達(dá)的基礎(chǔ)上，篩選包括銀杏葉提取物，丹參，大黃，前胡，桑白皮，紫苑等常見中藥中的各單體化合物對(duì)CYP1A1基因表達(dá)的抑制情況。
　　 方法：采用之前建立的人CYP1A1報(bào)告基因模型，在24孔板或48

13、孔板上接種HepG2細(xì)胞或LS174T細(xì)胞，12h之后轉(zhuǎn)染pT81/hCYP1a1_3×DRE進(jìn)細(xì)胞，4-6h后按所需的濃度加入待測(cè)藥物。孵育48h之后通過報(bào)告基因檢測(cè)基因表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.銀杏葉提取物中的槲皮素(Que)，山萘酚(Kae)，異鼠李素(Iso)和白果內(nèi)酯(BB)在基于HepG2細(xì)胞的模型上，可提高CYP1A1的轉(zhuǎn)錄活性。而銀杏內(nèi)酯A(GA)和銀杏內(nèi)酯B(GB)可降低CYP1A1的轉(zhuǎn)錄活性。而

14、在基于LS174T細(xì)胞的模型上，除槲皮素(Que)和銀杏內(nèi)酯A(GA)外，均可提高CYP1A1的轉(zhuǎn)錄活性。
　　 2.丹參中除丹參素鈉(SD)和隱丹參酮(CTan)外，在基于HepG2細(xì)胞的模型上，丹參酮Ⅰ(TanⅠ)，原兒茶醛(Proto)，丹酚酸B(SA-B)，丹參酮ⅡA(TanⅡA)均可明顯提高CYP1A1的轉(zhuǎn)錄活性。而在基于LS174T細(xì)胞的模型上，除丹參酮Ⅰ(TanⅠ)和隱丹參酮(CTan)外，均可提高CYP1A1的轉(zhuǎn)

15、錄活性。
　　 3.大黃中的大黃素(Emo)，大黃酚(Chr)，大黃素甲醚(Phy)，大黃酸(Rhe)，蘆薈大黃素(Alo)在基于HepG2細(xì)胞的模型上，均可降低CYP1A1的轉(zhuǎn)錄活性。而在基于LS174T細(xì)胞的模型上，除大黃素(Emo)外，均可提高CYP1A1的轉(zhuǎn)錄活性。
　　 4.白花前胡中的白花前胡甲素(PraA)，白花前胡丙素(PraC)，白花前胡丁素(PraD)，白花前胡素E(PraE)在基于HepG2細(xì)胞的模

16、型上，均可降低CYP1A1的轉(zhuǎn)錄活性。而在基于LS174T細(xì)胞的模型上，均可提高CYP1A1的轉(zhuǎn)錄活性。
　　 5.紫苑中的兩種有效成分紫苑酮(Shi)和表木栓醇(Epi)，以及桑色素(Mor)，桑皮苷A(Mul)，白藜蘆醇(Resveratrol)在基于HepG2細(xì)胞的模型上，除桑皮苷A(Mul)和紫苑酮(Shi)外均可提升CYP1A1的轉(zhuǎn)錄活性。而在基于LS174T細(xì)胞的模型上，均可提升CYP1A1的轉(zhuǎn)錄活性。
　　

17、 6.大黃素(Emo)在給予梯度濃度0.01μM，0.1μM，1μM，10μM，100μM的情況下，除0.1μM，1μM兩個(gè)給藥組產(chǎn)生了抑制作用，其它三個(gè)給藥組0.01μM，10μM，100μM都產(chǎn)生了誘導(dǎo)作用，并且在1μM以上的濃度呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。
　　 結(jié)論：本部分研究在前一部分的基礎(chǔ)之上，篩選了包括銀杏葉提取物，丹參，大黃，白花前胡，紫苑等常見中藥中的主要單體，以及桑皮苷A，桑色素，白藜蘆醇等，總共25個(gè)中藥單體化合

18、物對(duì)誘導(dǎo)高表達(dá)的CYP1A1的基因表達(dá)活性的作用。結(jié)果表明大部分化合物都能抑制處于高表達(dá)狀態(tài)的人CYP1A1基因轉(zhuǎn)錄活性。其中較為顯著的結(jié)果有大黃素(Emo)使CYP1A1的轉(zhuǎn)錄活性降低約70％。
　　 綜上所述，本研究建立了適合于高通量篩選的人CYP1A1報(bào)告基因方法，篩選和研究了包括銀杏葉提取物，丹參，大黃，前胡，桑白皮，紫苑等常見中藥中的共25個(gè)中藥單體化合物，對(duì)CYP1A1酶基因基礎(chǔ)表達(dá)和高表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇對(duì)