骨髓基質(zhì)細胞源性神經(jīng)活性蛋白的提取與純化的實驗研究.pdf

1、第一部分骨髓基質(zhì)細胞的培養(yǎng)和鑒定 目的:在體外培養(yǎng)大鼠骨髓基質(zhì)細胞(bonemarrowstromalcells，BMSCs)，觀察其其形態(tài)特征和分類并鑒定。 方法:取幼年SD大鼠骨髓，分離培養(yǎng)BMSCs，相差顯微鏡下觀察其形態(tài)，傳代后觀察其生長特點，用免疫組化方法加以鑒定。 結(jié)果:原代培養(yǎng)15天左右可分離得到BMSCs，在五代以前生長形態(tài)較穩(wěn)定，典型的BMSCs形態(tài)有兩個類型。免疫細胞化學染色顯示細胞表達CD2

2、9、CD54，但不表達CD34、Laminin。 結(jié)論:分離培養(yǎng)的BMSCs成分單一，適用于其神經(jīng)活性物質(zhì)提純的研究。 第二部分骨髓基質(zhì)細胞條件培養(yǎng)液中神經(jīng)活性物質(zhì)的提取與純化 目的:分離純化BMSCs培養(yǎng)液中蛋白，以獲得某些神經(jīng)活性物質(zhì)。探討從BMSCs培養(yǎng)液中提取與純化神經(jīng)營養(yǎng)因子的可行性。 方法:取幼年SD大鼠骨髓，采用直接貼壁法行BMSCs培養(yǎng)、傳代，選擇P2-P5，待細胞生長融合達80

3、％時采用無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)48小時后收集其培養(yǎng)液。對培養(yǎng)液超濾濃縮并離心后采用SephadexG-100層析以獲得不同組分的蛋白。行脊髓前角運動神經(jīng)元的培養(yǎng)，將得到的不同蛋白成分加入神經(jīng)細胞培養(yǎng)體系中，72h后行MTT實驗測得有神經(jīng)活性成分的蛋白。將所得到的蛋白行高效液相色譜分析(HPLC)分析，同樣將分離的各蛋白加入神經(jīng)細胞培養(yǎng)體系中，72h后采用MTT法測出神經(jīng)營養(yǎng)蛋白，同時對不同作用組神經(jīng)元采用NSE免疫組化染色，觀察其細胞狀態(tài)和測

4、量其軸突長度進一步證實其神經(jīng)活性作用。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠不連續(xù)電泳(SDS-PAGE)方法對最終得到的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白進行分析，并和標準蛋白分子量相比來確定其分子量。 結(jié)果:BMSCs培養(yǎng)液經(jīng)超濾濃縮后行SephadexG-100層析得到Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三個峰，MTT實驗證實工工工峰有明顯的神經(jīng)活性作用；對工Ⅲ峰行HPLC分析后得到A、B、C三個峰，通過MTT法和神經(jīng)軸突長度的測量，證實A峰和B峰對神經(jīng)細胞生長有明顯促進作

5、用。對A、B峰行SDS-PAGE分析，證實為單一蛋白帶，其分子量分別為18KD和14KD。 結(jié)論:BMSCs條件培養(yǎng)液中可分離出神經(jīng)活性物質(zhì)，其分子量分別為18KD和14KD。 第三部分骨髓基質(zhì)細胞胞漿中神經(jīng)活性物質(zhì)的提取與純化 目的:分離純化MSCs胞漿中神經(jīng)營養(yǎng)蛋白并驗證其神經(jīng)活性作用。以獲得某些神經(jīng)活性物質(zhì)。探討從BMSCs胞漿中直接提取與純化神經(jīng)營養(yǎng)因子的可行性。 方法:取幼年SD大鼠骨

6、髓，采用直接貼壁法行BMSCs培養(yǎng)、傳代，選擇P5，待細胞生長融合達80％時采用無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)48小時后用PBS漂洗細胞并收集，低溫下將MSCs超聲粉碎并離心。取上清液過超濾濃縮系統(tǒng)，由此獲得分子量大于10KD蛋白濃縮液6ml。對蛋白濃縮液采用SephadexG-100層析以獲得不同組分的蛋白。行脊髓前角運動神經(jīng)元的培養(yǎng)，將得到的不同蛋白成分加入神經(jīng)細胞培養(yǎng)體系中，72h后行MTT實驗測得到有神經(jīng)活性成分的蛋白。將所得到的蛋白行高效液

7、相色譜分析(HPLC)分析，同樣將分離的各蛋白加入神經(jīng)細胞培養(yǎng)體系中，72h后采用MTT法測出神經(jīng)活性蛋白，同時對不同作用組神經(jīng)元采用NSE免疫組化染色，觀察其細胞形態(tài)和測量其軸突長度進一步證實其神經(jīng)活性作用。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠不連續(xù)電泳(SDS-PAGE)方法對最終得到的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白進行分析，并和標準蛋白分子量相比來確定其分子量。 結(jié)果:BMSCs超聲粉碎后胞漿液經(jīng)超濾濃縮后行SephadexG-100層析得到

8、Ⅰ、Ⅱ兩個峰，MTT實驗證實Ⅱ峰有明顯的神經(jīng)活性作用；對Ⅱ峰行HPLC分析后得到A、B兩個峰，通過MTT法和神經(jīng)軸突長度的測量，證實A峰對神經(jīng)細胞生長有明顯促進作用。對A峰行SDS-PAGE分析，證實為單一蛋白帶，其分子量為13KD。 結(jié)論:BMSCs胞漿液中可分離出神經(jīng)活性物質(zhì)，其分子量分別為13KD。 第四部分骨髓基質(zhì)細胞表達神經(jīng)營養(yǎng)因子的實驗 目的:研究BMSCs是否能分泌腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(br

9、ain-derivedneurothophicfactor，BDNF)。 方法:分離培養(yǎng)小鼠BMSCs，利用第三代BMSCs為實驗對象，用酶聯(lián)免疫吸附分析(enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)分別檢測培養(yǎng)3d、5d、7d、10d時BDNF的表達和含量。 結(jié)果:BMSCs培養(yǎng)上清液中含有BDNF蛋白，其含量在培養(yǎng)第七天時達高峰。結(jié)論BMSCs能分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF，可從BMSCs培

10、養(yǎng)液中提取神經(jīng)營養(yǎng)因子。 第五部分不同劑量BMSCs胞漿提純活性蛋白對周圍神經(jīng)再生作用的實驗研究 目的:通過局部注射不同劑量的BMSCs胞漿提純活性蛋白觀察其對大鼠坐骨神經(jīng)損傷的再生作用。 方法:隨機選擇SD大鼠30只，行左側(cè)坐骨神經(jīng)切斷并造成3mm缺損，用6mm硅膠管套接縫合。其中10只(甲組)硅膠管內(nèi)注射高劑量BMSCs胞漿提純活性蛋白，10只(乙組)硅膠管內(nèi)注射低劑量BMSCs胞漿提純活性蛋白，1