耐冷菌Bacillus cereus SYP A2-3產(chǎn)冷適蛋白酶的研究.pdf

1、冷適蛋白酶在低溫下有較高的催化活性，在食品、化工、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，其研究已受到國(guó)內(nèi)外的廣泛重視。本文從中國(guó)冰川1號(hào)雪山微生物樣本中篩選獲得1株能夠產(chǎn)冷適蛋白酶的耐冷菌BacilluscereusSYPA2-3，并系統(tǒng)開(kāi)展了發(fā)酵產(chǎn)酶、分離純化和酶學(xué)性質(zhì)等多項(xiàng)研究，為深入開(kāi)發(fā)我國(guó)冷適微生物資源提供了素材，并在適冷機(jī)制的理論研究方面，提出了一些有價(jià)值的觀點(diǎn)。 SYPA2-3是一株革蘭氏陽(yáng)性芽孢桿菌，能在0-38℃范圍內(nèi)生

2、長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度在25℃，最大NaCl耐受濃度8％，能夠利用多種碳源和氮源，VP反應(yīng)、觸酶實(shí)驗(yàn)、明膠液化實(shí)驗(yàn)、M-R實(shí)驗(yàn)呈陽(yáng)性。實(shí)驗(yàn)測(cè)定了該株菌的16srDNA，在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中，該菌與Bacilluscereus和Bacillusthuringiensis有較近的親緣關(guān)系，結(jié)合表型分類和16srDNA序列比對(duì)結(jié)果，將SYPA2-3鑒定為蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)。 產(chǎn)酶條件研究顯示，SYPA2-3最適產(chǎn)酶溫度1

3、5℃，培養(yǎng)基最適初始pH6.5-7.0，可溶性淀粉、果糖和葡萄糖是較好的碳源，其適宜的濃度是10g/L，高濃度的糖能夠起到代謝阻遏作用。酪蛋白是較好的氮源，其適宜濃度是10-20g/L。 實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)地對(duì)蛋白酶的底物誘導(dǎo)作用和降解產(chǎn)物的阻遏作用進(jìn)行了研究。氨基酸殘基鏈長(zhǎng)35-55的肽類誘導(dǎo)產(chǎn)酶能力最強(qiáng)，而小分子氮源能夠阻遏蛋白酶的形成，因而氮源對(duì)蛋白酶合成的誘導(dǎo)和阻遏的雙重調(diào)節(jié)功能與肽鏈長(zhǎng)度有關(guān)。對(duì)粗料氮源，通過(guò)預(yù)水解可以提高培養(yǎng)基

4、中α-氨基氮水平，起到促進(jìn)菌體前期生長(zhǎng)作用，能夠較大幅度提高其蛋白酶產(chǎn)量，如預(yù)水解后的豆粕產(chǎn)酶增加了1100U/mL，這一機(jī)制可能應(yīng)用于其它蛋白酶的生產(chǎn)調(diào)節(jié)。 鑒于冷適微生物最適生長(zhǎng)溫度和產(chǎn)酶溫度的差異，實(shí)驗(yàn)研究了變溫培養(yǎng)方式。在近于最適溫度下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)可縮短培養(yǎng)時(shí)間，獲得較高的菌體濃度。采用搖瓶方式，20℃預(yù)培養(yǎng)16h比15℃恒溫發(fā)酵產(chǎn)酶提高28.2％。綜合應(yīng)用變溫培養(yǎng)、pH流加控制、氮源補(bǔ)加和產(chǎn)酶保護(hù)等控制策略，在5L小罐

5、發(fā)酵產(chǎn)酶為4840U/mL，其產(chǎn)酶高峰在45h，提前了5-8h。 采用超濾和分級(jí)鹽析操作能夠有效去除雜蛋白，超濾濃縮實(shí)現(xiàn)75.3％的回收率，分級(jí)鹽析酶活回收率達(dá)到56.0％。應(yīng)用離子交換(DEAEfastflow)、凝膠層析(SuperdexG75)實(shí)現(xiàn)了BacilluscereusNeutralProtease(BcNP)的分離和純化。嚴(yán)格的低溫操作、快速的純化方式和全程的酶蛋白保護(hù)措施是BcNP純化技術(shù)的關(guān)鍵。 Bc

6、NP分子量為34.2kDa，pI為4.8-5.0。以酪蛋白為底物，其最適催化溫度為42℃，最適pH范圍為7.0-8.5。Ca2+、Mn2+對(duì)其有一定的激活作用，Cu2+、Pb2+、Co2+對(duì)活性有一定的抑制，該酶不受絲氨酸型蛋白酶抑制劑PMSF的抑制，但受EDTA強(qiáng)烈抑制，具有金屬蛋白酶典型特性。 BcNP冷適性表現(xiàn)在三點(diǎn)：一是最適催化溫度在40℃左右，低于中溫酶近10℃；二是在低溫下具有相對(duì)較高的催化活力；三是在0℃仍具有一定

7、的催化能力。動(dòng)力學(xué)研究表明，BcNP在低溫下具有較高的催化效能，突出表現(xiàn)在15-35℃的范圍內(nèi)，Kcat/Km值變化不大，顯示出較好的冷適性。熱力學(xué)數(shù)據(jù)分析顯示，在25-30℃溫度區(qū)間的活化能最低，酶在該溫度區(qū)域處于較優(yōu)的催化構(gòu)象。 BcNP具有熱不穩(wěn)定性，這是冷適酶普遍的特性。該酶在0℃下酶活半衰期為24h，在40℃處理5min，酶活損失達(dá)到80％。Ca2+和低分子量醇類物質(zhì)能增強(qiáng)其熱穩(wěn)定性，其中異丙醇對(duì)酶的穩(wěn)定性效果最好，如

8、添加4％異丙醇的酶液在50℃處理20min后，仍能夠保留90％以上的酶活。甲醇對(duì)BcNP除了具有穩(wěn)定作用外，對(duì)酶活還有一定的激活作用，添加4％的甲醇可使酶活提高25％。酶液的光譜數(shù)據(jù)分析表明，醇類物質(zhì)加入到BcNP溶液中，能夠?qū)е略?50-270nm范圍紫外吸收的變化，其中4％乙醇、4％異丙醇使BcNP內(nèi)核氨基酸(Trp、Try、Phe)有所暴露，蛋白質(zhì)構(gòu)象舒張，而4％甲醇使內(nèi)核包裹趨于緊密，增強(qiáng)了內(nèi)核的剛性。但是熒光發(fā)射光譜分析認(rèn)為，

9、醇類物質(zhì)加入對(duì)酶蛋白分子構(gòu)象的總體影響是較小的，這種適度的作用使酶在構(gòu)象上更趨于穩(wěn)定。 通過(guò)酶蛋白N端測(cè)序，合成上下游引物，擴(kuò)增出BcNP的基因序列，該基因編碼了317個(gè)氨基酸，與B.cATCC14579中性蛋白酶基因同源度為94％。，氨基酸序列與PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中1NPC具有96.8％的相似度，具有差異的氨基酸共有10個(gè)，主要發(fā)生在芳香氨基酸之間、羥基氨基酸之間、堿性氨基酸之間以及酸性氨基酸及對(duì)應(yīng)的酰胺酸之間。通過(guò)結(jié)構(gòu)域序列分析，

10、將BcNP歸入MA宗族的M4家族，且系統(tǒng)分類為EC3.4.24.28。 利用Geno3d和Swiss-Model的Web服務(wù)器，構(gòu)建出BcNP的同源模型，從熱力學(xué)、立體化學(xué)和拉氏肽鏈結(jié)構(gòu)分布等方面對(duì)模建結(jié)果進(jìn)行了評(píng)價(jià)，優(yōu)選出一個(gè)合理性較好的模型，通過(guò)Swiss-Model進(jìn)一步優(yōu)化，獲得BcNP的同源模型。比較該模型與1NPC的三維結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)與構(gòu)效關(guān)系相關(guān)的差別主要體現(xiàn)在：極性氨基酸減少了，降低了形成鹽鍵的能力；氫鍵數(shù)目減少，造

11、成局部肽鏈伸展，總體結(jié)構(gòu)趨于松散；疏水性內(nèi)核局部暴露，溶劑可接近性大；比表面積較大，表面電勢(shì)能局部堆積。這些差別均與BcNP的熱不穩(wěn)定性和低溫下高催化活力有密切的關(guān)系。此外，比較還發(fā)現(xiàn)，BcNP在二級(jí)結(jié)構(gòu)上以多段結(jié)構(gòu)組成的α螺旋或β折疊結(jié)構(gòu)代替中溫酶結(jié)構(gòu)中的較長(zhǎng)的、連續(xù)的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件，使結(jié)構(gòu)上更富于柔韌性。 蛋白酶作為應(yīng)用最廣、產(chǎn)量最大的一類酶制劑，已在諸多領(lǐng)域創(chuàng)造了不可估量的經(jīng)濟(jì)與環(huán)境效益，但是在上述的工業(yè)體系中，還依然存在很