天冬氨酸六肽-丹參素(DD6)的合成及其骨組織靶向藥理效應(yīng)的初步研究.pdf

1、[目的]
　　 本實(shí)驗(yàn)將嘗試以天冬氨酸六肽為丹參素的骨靶向載體，設(shè)計(jì)并合成可能具有骨靶向性的化合物天冬氨酸六肽-丹參素(DD6)，并初步研究其藥理學(xué)效應(yīng)。
　　 [方法]
　　 1.天冬氨酸六肽-丹參素(DD6)的合成實(shí)驗(yàn)本文采用Fmoc固相合成法合成丹參素-天冬氨酸六肽(DD6)，固相載體選擇Wang樹脂，采用手工合成裝置，室溫下氮?dú)夤拇当Ｗo(hù)及攪拌。合成分三部分進(jìn)行：Fmoc-Asp(OtBu)-O-Wang樹

2、脂的合成，F(xiàn)moc-Asp(OtBu)-[Asp(OtBu)]4-Asp(OtBu)-O-Wang樹脂的合成，DD6的合成。粗品經(jīng)HPLC分離純化后冷凍干燥。結(jié)合HPLC、ESI-MS和1H-NMR對(duì)化合物進(jìn)行鑒定。
　　 2.DD6的親骨性研究實(shí)驗(yàn)以羥基磷灰石(HA)作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ腕w外初探DD6的骨靶向性，分別觀察HA對(duì)DD6及丹參素(DSU)的吸附特點(diǎn)，并比較它們對(duì)HA的親和力強(qiáng)弱，以此說(shuō)明DD6的親骨性強(qiáng)弱。化合物對(duì)HA的親

3、和力用吸附率及吸附量來(lái)表示，應(yīng)用HPLC測(cè)定吸附前后DD6或DSU的濃度。
　　 3.DD6對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響及對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)成骨分化的影響采用新生大鼠顱蓋骨成骨細(xì)胞(rOB)體外培養(yǎng)給藥，觀察DD6和DSU不同濃度和不同時(shí)間對(duì)rOB增殖的影響，判斷DD6是否具有促成骨細(xì)胞增殖作用，同時(shí)判斷DSU結(jié)合載體后增殖能力是否變化；體外培養(yǎng)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)，直接給藥觀察DD6及DSU對(duì)細(xì)胞堿性磷酸酶活性的影響，

4、判斷DD6對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響。
　　 [結(jié)果]
　　 最終得100mg凍干品，純度約為91.0％。第一個(gè)氨基的導(dǎo)入率可達(dá)98.6％，其余氨基酸的縮合率可達(dá)97.8％，六肽樹脂與丹參素的縮合率為53.3％，純化回收率為14.1％。結(jié)合HPLC、ESI-MS、1H-NMR結(jié)果驗(yàn)證其主要成份為DD6。
　　 羥基磷灰石吸附實(shí)驗(yàn)顯示HA對(duì)DD6的吸附率隨著DD6濃度的升高而逐漸下降，而其吸附量隨著DD6濃度的

5、升高而升高，當(dāng)DD6達(dá)到一定濃度時(shí)其吸附量趨于平衡；HA對(duì)DD6吸附率及吸附量隨著HA量的增加而升高。HA對(duì)DD6的吸附量約是DSU的60倍。
　　 DD6(2.5×10-7～2.5×10-6M)可促進(jìn)rOB增殖作用，作用在24h-48h增殖明顯。DSU(5.0×10-7M和2.5×10-6M)作用48 h增殖高峰。DD6促增殖能力有強(qiáng)于DSU的趨勢(shì)。
　　 DD6可誘導(dǎo)rMSCs成骨分化分泌ALP，濃度為5.0×10-

6、6M時(shí)作用最強(qiáng)，第21天仍有誘導(dǎo)作用。在實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)，DD6隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)誘導(dǎo)作用逐漸增強(qiáng)，作用有較DSU持久的趨勢(shì)。
　　 [結(jié)論]
　　 采用本實(shí)驗(yàn)合成方案可成功合成DD6，從第一個(gè)氨基酸與樹脂的連接反應(yīng)開始，總合成率為6.6％。
　　 DD6具有骨靶向性，親骨性強(qiáng)于DSU；六肽載體使得DSU的親骨性得以提高，預(yù)示DSU在骨組織中的分布將會(huì)增多。
　　 DD6的體外藥效研究證明其具有促成骨細(xì)胞增殖及