水產(chǎn)品中恩諾沙星殘留一步式酶聯(lián)免疫快速檢測方法的研究.pdf

1、恩諾沙星(Enrofloxacin)是一種化學(xué)合成的廣譜抗菌藥物，是氟喹諾酮類藥物的代表產(chǎn)品，廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖、臨床等各個領(lǐng)域。該類藥物的耐藥性、殘留毒性以及不良反應(yīng)等的報道越來越多。世界許多國家都針對該類藥物制定了動物性食品中的最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)。恩諾沙星的檢測一般采用色譜法作為確證性檢測方法；近年來快速篩選檢測的免疫分析方法引起越來越多的關(guān)注。 本研究旨在建立水產(chǎn)品中恩諾沙星殘留的一步式ELISA快速檢測方法，以進一步提高快速篩

2、選檢測效率。通過對傳統(tǒng)兩步式間接競爭ELISA競爭反應(yīng)模式、反應(yīng)時間、洗滌時間等主要因素的優(yōu)化改進，建立了恩諾沙星一步式間接競爭ELISA檢測體系；利用不同的偶聯(lián)方法，建立并優(yōu)化了恩諾沙星酶標(biāo)抗體的合成方法，并以所制備的酶標(biāo)抗體為基礎(chǔ)建立了標(biāo)記抗體型一步式直接競爭ELISA檢測模式，并進行了加標(biāo)水產(chǎn)樣品的檢測驗證。主要實驗結(jié)果如下： 1.間接競爭ELISA中，采用平衡飽和模式，在競爭反應(yīng)中比較理想的競爭反應(yīng)物添加順序是酶標(biāo)二抗—

3、—待測抗原——特異性抗體，在適當(dāng)提高抗體濃度的前提下，可以將傳統(tǒng)兩步式簡化為一步式，檢測時間由總的4h以上，縮減到2h左右。對水產(chǎn)樣品在10μg/kg～200μg/kg的加標(biāo)范圍內(nèi)，檢測的平均回收率可達到70％以上，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差低于15％。此外，不同聚合度(PEG4000、6000、20000)、濃度(1％-9％)的聚乙二醇作為反應(yīng)加速劑對恩諾沙星間接競爭ELISA檢測的加速作用不顯著。 2.首次采用過碘酸鈉氧化法合成酶標(biāo)恩諾沙

4、星抗體，根據(jù)紫外掃描結(jié)果計算出酶標(biāo)抗體的克分子比為1.6，酶結(jié)合量為1.2 mg/mL、酶結(jié)合率約為40％，均處于較好的質(zhì)量范圍內(nèi)；ELISA效價測定結(jié)果表明，酶標(biāo)抗體的效價達到10000×以上，工作效價在1000×左右，標(biāo)記前后抗體親和活性保持良好；所制備的酶標(biāo)恩諾沙星抗體對于主要同族藥物的交叉反應(yīng)率均低于1％。 3.采用N-琥珀酰胺-3-(2-吡啶二硫)丙酸酯(SPDP)和硫酸化-琥珀酰胺-4-[N-馬來酰胺甲基]-環(huán)己烷-

5、羧酸酯(Sulfo-SMCC)兩種異型雙功能交聯(lián)劑(可分別提供為6.8A和8.3A空間臂長)交聯(lián)制備酶標(biāo)抗體，所設(shè)定的HRP和IgG的用量、DTT作用的pH體系、交聯(lián)劑對蛋白的作用pH體系等影響因素的實驗結(jié)果表明，交聯(lián)劑對蛋白作用的pH體系對交聯(lián)結(jié)果的影響顯著；兩種交聯(lián)劑比較，空間臂較長的Sulfo-SMCC的性能略好。 4.利用高碘酸鈉法所制備的恩諾沙星酶標(biāo)記抗體，建立了標(biāo)記抗體型一步式直接競爭ELISA(Dc-ELISA)。

6、根據(jù)所用抗體種類及純化方式的不同，方法的最低檢測限可以達到5μg/kg-10μg/kg，在設(shè)定的10μg/kg-40μg/kg的加標(biāo)濃度下，檢測的平均回收率可達到70％，批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在10％以下。 5.標(biāo)記抗體型一步式直接競爭ELISA檢測方法應(yīng)用于在水產(chǎn)樣品檢測的HPLC驗證結(jié)果表明，Dc-ELISA和HPLC方法呈現(xiàn)較好的相關(guān)性(R2可以達到0.95以上)，且一步式Dc-ELISA檢測方法所需時間僅為2h左右，樣品前處理