胰腺十二指腸同源盒（PDX-1）在2型糖尿病大鼠胰腺組織中的表達及羅格列酮的干預作用.pdf

1、目的：2型糖尿病的病因極為復雜，目前尚未完全清楚，但其發(fā)病的中心環(huán)節(jié)是胰島素抵抗和胰島素的分泌缺陷，胰島素分泌缺陷在從NGT到IGT和IGT到糖尿病的過程，起了決定性的作用。長期高血糖、高血脂是胰島素分泌缺陷發(fā)生的始動因素，也是糖尿病的重要特征。糖脂毒性可以損傷在胰島素分泌中起重要作用的轉錄因子胰腺十二指腸同源盒(PDX-1)，使得胰島素分泌減少。機體發(fā)育成熟后，PDX-1作為轉錄因子在胰腺中特異性表達，可以促進胰腺的早期發(fā)育和晚期胰島

2、細胞的分化，調(diào)節(jié)胰島素基因及胰島素分泌相關基因的表達，影響胰島素的合成分泌。PDX-1表達受損導致的胰島素分泌減少，進一步加重了糖尿病的糖脂代謝紊亂。因此，研究糖尿病發(fā)生發(fā)展過程中PDX-1的表達變化，尋找和發(fā)現(xiàn)調(diào)控PDX-1表達和功能的藥物，對闡明糖尿病發(fā)病機制、進行有效的治療和減緩糖尿病的發(fā)展均具有重要意義。 本實驗擬通過觀察長期高脂飲食加小劑量STZ誘導的大鼠糖尿病模型中胰島素變化和PDX-1的表達變化，探討PDX-1在糖

3、尿病發(fā)病中的作用；并通過應用TZD類藥物羅格列酮(rosiglitazone)進行干預，探討TZD改善胰島細胞功能的作用機制。 方法：健康Whistar雄性大鼠45只，適應性喂養(yǎng)2周，隨機分為普通飲食組(A組)15只，和高脂飲食組30只，給予高脂飲食喂養(yǎng)2月，按HOMA指數(shù)判斷出現(xiàn)胰島素抵抗后，腹腔注射STZ(streptozotocin，STZ )造模。將成模大鼠(共24只)隨機分為兩組(每組12只)： 2型糖尿病未干預組(B

4、組)，繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)；羅格列酮治療組(C組)高脂飼料加羅格列酮，繼續(xù)喂養(yǎng)2個月。所有大鼠實驗期間自由飲水、進食。分籠飼養(yǎng)，每籠4-5只。 每組大鼠均于實驗開始、結束時稱量體重、取血。大鼠自試驗前一日20:OO起禁食，試驗日8:00分別自內(nèi)眥靜脈采血，分離血清，保存于-20℃，用于各指標的檢測。實驗結束時留取胰腺組織一部分液氮保存，用于測定InsulinmRNA和PDX．1RNA表達；一部分組織．80凍存，用于測定PDX-1蛋

5、白表達；其余部分以4％中性多聚甲醛固定，待組織學檢查。 1 血糖、胰島素的測定血糖用葡萄糖氧化酶法測定；胰島素用放射免疫法測定。采用穩(wěn)態(tài)模型(Homeoestasis Model Assessment，HOMA)及胰島素敏感指數(shù)(Insulin Sensitivity Index，ISI)評價胰島素抵抗的程度。 2 血脂的測定甘油三脂(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterole，T

6、C)、高密度脂蛋白膽固醇(highdensity lipoprotein-cholesterole，HDL-C)比色法測定，Cu<'2+>比色法測定游離脂肪酸(FFA)含量。 3 口服糖耐量試驗(OGTT)大鼠試驗結束前行0GTT試驗。步驟如下：大鼠自試驗前一日20：00起禁食，試驗日8：OO用葡萄糖灌胃2.0g/kg體重，于灌胃前(0min)、灌胃后30min、60min、120 min、180min分別自內(nèi)眥靜脈采血0.5

7、-1ml，測血糖、胰島素。即刻測血糖，余血標本離心，血清貯存于-20℃冰箱待檢。 4 胰腺組織InsulinmRNA和PDX-1mRNA表達的測定用Trizol Kit提取胰腺組織RNA，反轉錄．聚合酶鏈反應(RT-PCR)分別擴增Insulin、PDX-+1和β-actin mRNA，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳、攝片和計算機圖像掃描。RT-PCR產(chǎn)物半定量：因β-actin在組織中均勻表達，Insulin、PDX-1基因的表達水平

8、用靶基因與β-actin的比值表示。 5 胰腺組織PDX-1蛋白表達的測定提取胰腺組織總蛋白并考馬氏亮藍G250法進行蛋白定量，依照常規(guī)Wrestem Blot操作步驟進行，凝膠成像系統(tǒng)對所獲條帶進行分析。PDX-1蛋白的表達水平用PDX-1與β-actin的比值表示。 6 形態(tài)學檢查常規(guī)方法制備大鼠胰腺光鏡組織切片，行HE及Insulin、PDX-1免疫組化染色。 7 統(tǒng)計學處理所有數(shù)據(jù)用SPSS11.0

9、軟件處理，計量資料以均數(shù)±標準差(?±S)表示，組間差異用兩樣本均數(shù)的t檢驗進行比較，兩組以上比較采用單因素方差分析作統(tǒng)計學處理。檢驗的顯著性用P值表示。P<0.05為差異有顯著性，P<0.01為差異有極顯著性。 結果： 1 對體重的影響實驗初，大鼠隨機分組，各組體重無統(tǒng)計學差別，具有可比性。實驗末，模型組體重(398.67±26.83g)明顯高于正常對照組(370.93±16.60g)，有顯著性差異(P<0.01)。羅

10、格列酮干預組(388.87±17.86g)體重與正常對照組相比有顯著性差異(P<0.01)，與糖尿病模型組比較雖有降低的趨勢，但無統(tǒng)計學意義。 2 對血脂的影響STZ造模后模型組大鼠的(TC)、(TG)、及FFA均明顯升高，與正常組相比有顯著性差異(P<0.01)；HDL降低，與正常組相比有顯著性差異(P<0.01)。羅格列酮干預組的(TC)、(TG)、及FFA比模型組明顯降低(P<0.01)，但仍高于正常組(P<0.05-0

11、.01)；HDL經(jīng)干預后模型組升高(P<0.05)，但仍低于正常對照組(P<0.01)。 3 OGTT結果實驗結束時，空腹血糖及葡萄糖灌胃后30、60、120、180min各時間點血糖糖尿病模型組均明顯高于NC組(P<0.01)。羅格列酮干預組各時間點血糖均明顯低于模型組(P<0.01)。胰島素抵抗指數(shù)模型組(2.96±0.34)明顯高于正常對照組(1.13±0.23)(P<0.01)，而胰島素敏感指數(shù)(-6.06±0.29)

12、明顯低于正常組(-4.38±0.22)(P<0.01)，經(jīng)羅格列酮治療后兩者均得到改善。 4 葡萄糖刺激的β細胞胰島素釋放功能正常對照組空腹胰島素水平(15.08±2.16mIU/L)，血漿胰島素于口服葡萄糖后60 min達峰值(84.83±1.73 mIU/L)，約為基礎值的5.6倍。糖尿病模型組空腹胰島素水平(29.14±5.11 mIU/L)較正常組顯著升高(P<0.01)，血漿胰島素于口服葡萄糖后120min達峰值(1

13、02.72±2.88 mIU/L)，明顯延遲且僅為基礎值的3.5倍。羅格列酮干預組空腹胰島素水平(18.04±2.30mIU/L)較模型組明顯降低(P<0.01)，血漿胰島素于口服葡萄糖后60 min達峰值(80.5±1.70mIU/L)。胰島素釋放曲線接近正常形態(tài)。 5 胰腺病理形態(tài)的改變HE染色光鏡下觀察，模型組大鼠胰腺與正常對照組比較無明顯改變。 6 免疫組化胰腺組織Insulin和PDX-1蛋白表達水平變化免疫

14、組化顯示陽性胰島β細胞胞漿呈棕黃色，模型組胰腺胰島中胰島素染色陽性區(qū)域面積百分比值(β/T area，％)(12.75±2.18)顯著低于正常對照組(42.61±2.68)，有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，經(jīng)羅格列酮干預后(20.67±2.14)較糖尿病模型組顯著增加(P<0.01)，但仍低于正常對照組(P<0.01)，提示經(jīng)羅格列酮干預后胰島細胞數(shù)量明顯增加；光密度各組無顯著性差異，提示各組問B細胞內(nèi)胰島素含量無明顯差異。PDX-1在胰

15、島細胞胞漿和胞核中均有表達，糖尿病模型組(0.240±0.051)的表達水平較正常對照組(0.648±0.087)顯著降低，經(jīng)羅格列酮干預后(0.460±0.045)PDX-1表達較模型組顯著增高(P<0.01)，較正常組仍處于低水平(P<0.01)。 7 胰腺組織InsulinmRNA和PDX-1mRNA表達水平的變化在模型組大鼠胰腺組織Insulin mRNA(0.21±0.023)和PDX-1mRNA(0.153±0.0

16、71)的表達明顯低于正常對照組(0.527±0.025)和(0.49±0.032)(P<0.01)，羅格列酮干預組(0.351±0.035)和(0.370±0.029)與模型組比較明顯增高(P<0.01)。 8 Western B10t胰腺組織PDX-1蛋白表達水平變化模型組胰腺PDX-1蛋白表達水平(0.253±0.028)明顯低于正常對照組(0.720±0.036)(P<0.01)，給予羅格列酮治療后(0.59±0.050

17、)表達增強(P<0.01)，但仍低于正常對照組。 結論 1 長期高脂飼養(yǎng)并小劑量STZ腹腔注射可成功復制2型糖尿病實驗模型，表現(xiàn)在血糖、血脂增高，β細胞量減少，葡萄糖刺激的胰島素分泌第一時相明顯減弱，第二時相高峰延遲。 2 2型糖尿病大鼠血糖、血脂增高，β細胞量減少同時，InsulinmRNA和PDX-1mRNA及其相應蛋白的表達水平均下降，提示了PDX-1在糖尿病發(fā)病中的作用。 3 PPAR-γ激