共聚集顯微內(nèi)鏡在體診斷胃黏膜上皮內(nèi)瘤變和胃癌分子成像的研究.pdf

1、背景和目的：
　　 目前胃癌仍是世界上病死率排名第二位的惡性腫瘤。1988年，Correa提出的慢性萎縮性胃炎-胃黏膜腸上皮化生-胃黏膜不典型增生-腸型胃癌的多階段胃癌發(fā)展模型已被較多臨床隨訪研究、胃癌手術(shù)切除標(biāo)本及基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)等所驗(yàn)證。故萎縮性胃炎、胃黏膜腸上皮化生及不典型增生(Dysplasia)均為公認(rèn)的胃黏膜癌前病變。盡管如此，胃黏膜不典型增生作為腸型胃癌形成的倒數(shù)第二步演變步驟，是胃腺癌最為直接的癌前病變，其早期診斷對防治

2、胃癌具有十分重要的臨床意義。2010年，世界衛(wèi)生組織正式提出用“上皮內(nèi)瘤變(IntraepithelialNeoplasia)”取代“不典型增生”。
　　 內(nèi)鏡檢查是早期發(fā)現(xiàn)胃黏膜瘤變的最有效手段。尤其是近年來應(yīng)用于臨床的先進(jìn)的內(nèi)鏡技術(shù)如高清晰內(nèi)鏡、放大內(nèi)鏡、色素內(nèi)鏡及窄帶成像(Narrow-bandImaging，NBI)等，均可提供胃黏膜表面顏色及細(xì)微結(jié)構(gòu)變化的高清晰圖像。然而，早期胃黏膜瘤變的內(nèi)鏡下宏觀改變?nèi)狈μ禺愋?，故雖

3、然上述內(nèi)鏡技術(shù)可以一定程度提高早期胃癌的檢出率，但仍無法觀察到胃黏膜上皮細(xì)胞、腺體和微血管等顯微結(jié)構(gòu)的改變。因此，為確診病變，內(nèi)鏡醫(yī)師仍需留取多塊活檢標(biāo)本，由此造成的活檢瘢痕對胃黏膜上皮內(nèi)瘤變(GastricIntraepithelialNeoplasia,GIN)患者短期內(nèi)實(shí)行內(nèi)鏡治療亦有諸多不良影響。此外，活檢標(biāo)本的組織病理學(xué)檢查需耗費(fèi)2-3天時(shí)間，對于確診為高級別上皮內(nèi)瘤變（High-gradeIntraepithelialNeo

4、plasia,HGIN）和早期胃癌的患者來說，不但有可能延誤治療時(shí)機(jī)，而且增加了患者的精神與經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。
　　 共聚焦激光顯微內(nèi)鏡(ConfocalLaserEndomicroscopy，CLE)是一種新型的內(nèi)鏡技術(shù)，可以在白光內(nèi)鏡觀察的同時(shí)，通過靜脈注射或黏膜表面噴灑熒光造影劑，實(shí)時(shí)觀察消化道黏膜上皮細(xì)胞、腺體及血管等顯微結(jié)構(gòu)，獲取類似病理組織學(xué)的顯微內(nèi)鏡圖像。CLE的問世為胃黏膜癌前病變及早期胃癌的診斷提供了新的有力工具。然而

5、，目前尚無研究將其應(yīng)用于胃黏膜上皮內(nèi)瘤變的診斷。
　　 早期診斷是改善胃癌患者預(yù)后的關(guān)鍵。內(nèi)鏡活檢雖為目前公認(rèn)的診斷胃癌的金標(biāo)準(zhǔn)，但仍存在致使病變形態(tài)改變、引發(fā)出血、穿孔等并發(fā)癥的潛在缺陷。此外，常規(guī)內(nèi)鏡活檢的病理組織學(xué)確診病變后再行內(nèi)鏡下治療還會延后治療時(shí)間，增添患者的心理和醫(yī)療負(fù)擔(dān)。因此，目前亟需一種能夠?qū)崿F(xiàn)實(shí)時(shí)顯微組織觀察的內(nèi)鏡技術(shù)，使醫(yī)師在普通內(nèi)鏡檢查的同時(shí)觀察到病變的顯微結(jié)構(gòu)改變并立即做出診斷，采取相應(yīng)的治療措施，從而

6、提高胃癌的檢出率和診斷、治療水平。近年來，已有多項(xiàng)研究致力于將CLE應(yīng)用于在體診斷胃癌;研究結(jié)果顯示，根據(jù)已制定的CLE形態(tài)學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)，共聚焦激光顯微內(nèi)鏡能夠較為準(zhǔn)確的鑒別胃黏膜癌變病變與非癌變病變。但上述研究均采用對患者靜脈注射熒光素鈉作為對比劑，獲取胃黏膜顯微結(jié)構(gòu)的非特異性熒光成像，無法達(dá)到對胃腸道黏膜疾病功能性和分子水平改變進(jìn)行觀察的目的。近期幾項(xiàng)研究表明，利用熒光物質(zhì)標(biāo)記的特異性抗體，CLE能夠?qū)崿F(xiàn)活體內(nèi)分子水平的觀察。

7、　　 因此，本課題擬圍繞胃黏膜上皮內(nèi)瘤變和胃癌的顯微內(nèi)鏡診斷方面展開研究，主要研究目的為:(1)探討利用CLE對胃黏膜非瘤變和瘤變病變進(jìn)行鑒別診斷的可行性，前瞻性評估CLE對胃黏膜上皮內(nèi)瘤變進(jìn)行實(shí)時(shí)診斷和分級診斷的效能;(2)系統(tǒng)研究CLE對胃癌活體分子成像的可行性。
　　 方法：
　　 第一部分:共聚焦激光顯微內(nèi)鏡在體診斷胃黏膜上皮內(nèi)瘤變的可行性研究
　　 研究過程分為兩個(gè)階段，第一階段采用共聚焦激光顯微內(nèi)鏡

8、對已知正常胃黏膜、非瘤變和胃黏膜上皮內(nèi)瘤變的病變進(jìn)行檢查，將所掃描部位的共聚焦激光顯微內(nèi)鏡圖像與相應(yīng)部位橫切面的組織病理學(xué)圖像進(jìn)行對比，制定共聚焦激光顯微內(nèi)鏡對胃黏膜病變的鑒別診斷標(biāo)準(zhǔn)和GIN分級診斷的標(biāo)準(zhǔn)體系。第二階段，前瞻性的納入2009年7月至2010年1月間于齊魯醫(yī)院胃鏡室預(yù)約行CLE檢查且符合相應(yīng)納入標(biāo)準(zhǔn)的患者為研究對象。由CLE操作者對胃黏膜病變進(jìn)行實(shí)時(shí)CLE診斷;由另外一名未參與實(shí)時(shí)診斷的有經(jīng)驗(yàn)的內(nèi)鏡醫(yī)師在檢查結(jié)束后對所留

9、取的圖片進(jìn)行盲法診斷。以病理組織學(xué)診斷結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，驗(yàn)證上述診斷標(biāo)準(zhǔn)。為了評估觀察者間和觀察者內(nèi)的一致性，我們還邀請了3名內(nèi)鏡醫(yī)師和1名病理醫(yī)師獨(dú)立地對前瞻性研究中的50處病變的共聚焦圖像按本研究制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類診斷。其中一名內(nèi)鏡醫(yī)師間隔一周后再次對這50處病變的CLE圖像進(jìn)行診斷。
　　 第二部分:共聚焦激光顯微內(nèi)鏡對胃癌活體分子成像的研究
　　 研究分為3個(gè)步驟，分別為細(xì)胞學(xué)研究、胃癌荷瘤鼠動(dòng)物模型體內(nèi)分子成像

10、和人體新鮮組織體外研究。
　　 (1)將BGC823和SGC7901這2種人源性胃癌細(xì)胞系分別與AF488-MG7抗體，同型對照抗體，或PBS體外共孵育，首先進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析，然后利用CLE（FIVE1，Optiscan）對未固定的活細(xì)胞進(jìn)行顯微熒光成像，熒光顯微鏡觀察;最后進(jìn)行MG7抗原細(xì)胞學(xué)免疫組織化學(xué)染色。
　　 (2)建立上述兩種胃癌細(xì)胞系的荷瘤鼠動(dòng)物模型，心內(nèi)注射AF680-MG7抗體或AF680-同型對照抗

11、體，利用小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)(Kodak2000MM，Kodak，USA)對其進(jìn)行整體動(dòng)態(tài)觀察，總結(jié)腫瘤特異性熒光成像的最佳抗體劑量及時(shí)間。然后根據(jù)上述結(jié)果進(jìn)行CLE荷瘤鼠體內(nèi)顯微水平的分子成像。對CLE觀察部位的組織進(jìn)行MG7抗原免疫組織化學(xué)染色，以相同荷瘤鼠的肝臟組織為陰性對照。
　　 (3)選取新鮮胃癌組織及相同患者的非癌組織的手術(shù)標(biāo)本(5～10mm)或內(nèi)鏡活檢標(biāo)本為研究對象，與AF488-MG7抗體溶液共孵育，然后立即用C

12、LE(FIVE1，Optiscan)進(jìn)行觀察。全部CLE操作均由同一研究者完成，該研究者在進(jìn)行CLE觀察時(shí)不知曉標(biāo)本的病理組織學(xué)診斷和位置來源。將CLE圖像利用半定量方法分為陰性(0)，弱陽性(+)，陽性(++)和強(qiáng)陽性（+++）4個(gè)等級，由另外3位有經(jīng)驗(yàn)的CLE研究者分別盲法獨(dú)立對CLE圖片進(jìn)行半定量分析，從而評估該CLE分子成像半定量評估體系的可靠性。CLE掃描結(jié)束后將標(biāo)本行HE染色和MG7抗原免疫組化實(shí)驗(yàn)。以病理組織學(xué)診斷作為本實(shí)

13、驗(yàn)的金標(biāo)準(zhǔn)。對所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果利用Spearman相關(guān)系數(shù)評估CLE半定量結(jié)果與相應(yīng)的免疫組化半定量結(jié)果的相關(guān)性。
　　 結(jié)果：
　　 第一部分:
　　 前瞻性研究共納入75例患者，包括91處可見病變，留取CLE圖像15093張。利用本研究中制定的CLE胃黏膜病變鑒別診斷標(biāo)準(zhǔn)，CLE最終診斷GIN的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、陽性似然比和陰性似然比分別為77.8％(95％CI,63.7％-87.5％),8

14、1.8％(95％CI,68.0％-90.5％),81.4％(95％CI,67.4％-90.3％),78.3％(95％CI,64.4％-87.7％),4.28(95％CI,2.24-8.16)和0.27(95％CI，0.16-0.48)。CLE實(shí)時(shí)診斷與最終診斷的準(zhǔn)確度比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.549)。
　　 觀察者間一致性的平均Kappa值為0.70（內(nèi)鏡醫(yī)師之間）和0.71（內(nèi)鏡醫(yī)師與病理醫(yī)師之間）。觀察者內(nèi)一致性亦較高（k

15、appa=0.78）。上皮內(nèi)瘤變評分≥5用于區(qū)分高級別和低級別上皮內(nèi)瘤變的靈敏度和特異度分別為66.7％和88.0％。
　　 第二部分:
　　 (1)流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示本研究中所使用的BGC823和SGC7901胃癌細(xì)胞系均存在MG7-Ag的表達(dá);CLE(FIVE1，Optiscan)圖像顯示細(xì)胞膜和胞漿的特異性熒光信號;即刻臺式熒光顯微鏡觀察結(jié)果與CLE相似。細(xì)胞免疫組化結(jié)果也驗(yàn)證了上述兩種細(xì)胞系的細(xì)胞膜和胞漿中存

16、在MG7-Ag的表達(dá)。
　　 (2)荷瘤鼠整體動(dòng)態(tài)熒光成像觀察結(jié)果顯示，心內(nèi)注射AF680-MG7抗體（1μg/g體重）避光飼養(yǎng)24小時(shí)后，小動(dòng)物活體成像儀攝取的圖像中即可見腫瘤部位出現(xiàn)特異性熒光信號。該腫瘤部位的特異性熒光信號在48小時(shí)達(dá)最強(qiáng)。CLE觀察腫瘤表面均可見特異性熒光信號;體外免疫組化結(jié)果和臺式熒光顯微鏡觀察冰凍切片的圖像與體內(nèi)CLE圖像相似。
　　 (3)共前瞻性納入了46例新鮮的人組織標(biāo)本，包括18例手術(shù)

17、標(biāo)本和28例內(nèi)鏡活檢標(biāo)本（來自23例胃癌患者）。23例胃癌組織標(biāo)本中有22例在CLE實(shí)驗(yàn)中觀察到了特異性熒光信號（+～+++），而非癌組織標(biāo)本則無或僅有弱熒光信號(0或+，n=18，n=5)。CLE半定量分析結(jié)果與不同等級的免疫組化結(jié)果的相關(guān)性較好（Spearmanr=0.87，P＜0.001）。CLE圖像半定量分析方法的觀察者間一致性較高(ICC=0.883，95％可信區(qū)間:0.819～0.929)。
　　 結(jié)論：
　　

18、 1.通過識別共聚焦顯微圖像中腺體結(jié)構(gòu)、細(xì)胞形態(tài)和血管結(jié)構(gòu)的特征性改變，可以區(qū)分正常胃黏膜、非瘤變病變及胃黏膜上皮內(nèi)瘤變病變。
　　 2.通過制定共聚焦顯微圖像瘤變改變的評分系統(tǒng)，可初步區(qū)分低級別和高級別上皮內(nèi)瘤變。
　　 3.CLE診斷胃黏膜上皮內(nèi)瘤變的觀察者間和觀察者內(nèi)一致性較高，具有較好的可靠性。
　　 4.利用熒光標(biāo)記的MG7抗體，CLE可以對胃癌荷瘤鼠進(jìn)行活體內(nèi)顯微水平的靶向分子成像;CLE對胃癌患者

19、的新鮮黏膜組織體外熒光分子成像的結(jié)果與傳統(tǒng)的體外免疫組織化學(xué)染色結(jié)果相關(guān)性好。
　　 研究意義：
　　 本研究證實(shí)CLE可清晰識別GIN特征性的細(xì)胞異常、結(jié)構(gòu)紊亂和微血管變化，建立的CLE下胃黏膜病變的診斷標(biāo)準(zhǔn)可實(shí)時(shí)區(qū)分GIN病變與非瘤變病變。CLE對GIN的分類診斷標(biāo)準(zhǔn)的觀察者間及觀察者內(nèi)一致性均較高，說明該診斷標(biāo)準(zhǔn)的可靠性較好。利用CLE圖像中GIN的改變的嚴(yán)重程度的差異可以對GIN進(jìn)行分級診斷，高特異度的實(shí)時(shí)鑒別診

20、斷HGIN病變，從而使內(nèi)鏡醫(yī)師對病變部位即刻進(jìn)行內(nèi)鏡下治療，避免治療時(shí)機(jī)的延誤、活檢疤痕對內(nèi)鏡治療的不良影響以及醫(yī)療資源的重復(fù)消耗。本研究首次利用熒光標(biāo)記的MG7抗體，以CLE為觀察手段，實(shí)現(xiàn)了對胃癌荷瘤鼠的活體內(nèi)靶向分子成像和人體活組織的體外分子成像。CLE作為一種新的在體顯微分子成像技術(shù)，有助于提高胃癌的診斷效能，準(zhǔn)確篩選MG7-Ag陽性的患者。盡管該項(xiàng)技術(shù)的臨床價(jià)值尚待進(jìn)一步人體內(nèi)研究的驗(yàn)證，我們目前的研究結(jié)果已初步確定了CLE輔