共聚焦激光顯微內(nèi)鏡在胃癌及癌前病變?cè)\斷和胃癌分子成像中的研究.pdf

1、背景與目的:
　　我國(guó)是胃癌及其癌前病變高發(fā)的國(guó)家，形勢(shì)嚴(yán)峻。胃腸道內(nèi)窺鏡檢查是早期發(fā)現(xiàn)胃黏膜病變的最直接有效的手段。共聚焦激光顯微內(nèi)鏡(Confocal LaserEndomicroscopy，CLE)形態(tài)成像功能和分子成像功能，使其在診斷胃癌及其癌前病變中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，然而目前研究數(shù)據(jù)有限。本研究旨在通過分析探頭式共聚焦激光顯微內(nèi)鏡(Probe-based CLE，pCLE)在診斷萎縮性胃炎(Atrophic Gastrit

2、is，AG)、胃黏膜腸上皮化生（Gastric Intestinal Metaplasia，GIM）及其亞型、低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變(Low-grade Intraepithelial Neoplasia，LGIN)和高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變(High-grade Intraepithelial Neoplasia，HGIN)中的效能，以及通過以熒光基團(tuán)標(biāo)記的抗HER2抗體作為分子探針，利用pCLE鑒別HER2過表達(dá)的胃癌細(xì)胞株和胃癌荷瘤鼠等一系列研

3、究，來闡明pCLE在胃癌及癌前病變中的形態(tài)成像和分子成像作用。
　　方法:
　　1.共聚焦激光顯微內(nèi)鏡在胃癌及癌前病變?cè)\斷中的作用本研究收集了2013年12月至2014年11月于浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院行上消化道pCLE檢查的患者資料，由兩名具有三年以上pCLE讀片經(jīng)驗(yàn)的內(nèi)鏡醫(yī)師回顧性閱讀每一位患者的pCLE保存錄像，并以以下標(biāo)準(zhǔn)做出pCLE診斷。以“胃小凹數(shù)目減少、胃小凹開口擴(kuò)張”作為AG的pCLE下診斷標(biāo)準(zhǔn)，以“觀察到

4、杯狀細(xì)胞、柱狀吸收細(xì)胞、紋狀緣或絨毛狀上皮”作為GIM的pCLE下診斷標(biāo)準(zhǔn)，以“輕、中度異型胃小凹結(jié)構(gòu)（胃小凹寬度和上皮層厚度大小不一），微血管管徑增大，不同程度的熒光素鈉外滲，形態(tài)扭曲”作為L(zhǎng)GIN的pCLE下診斷標(biāo)準(zhǔn)，以“胃小凹結(jié)構(gòu)明顯異型（上皮層明顯形態(tài)改變）或無明顯腺體結(jié)構(gòu)，微血管形態(tài)不規(guī)則，管徑增大，數(shù)目增多”作為HGIN的pCLE下診斷標(biāo)準(zhǔn)，以病理診斷作為金標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)分析pCLE診斷AG、GIM、LGIN、HGIN的靈敏度、

5、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、陽(yáng)性似然比、陰性似然比、約登指數(shù)及相應(yīng)95％置信區(qū)間(confident interval，CI)和符合率及κ值。此外，以“具有完整紋狀緣的非分泌吸收細(xì)胞和散在分布的杯狀細(xì)胞”作為完全型GIM的pCLE下診斷標(biāo)準(zhǔn)，以“胃黏膜上皮細(xì)胞和散在分布的杯狀細(xì)胞，或由高柱狀細(xì)胞和散在分布的杯狀細(xì)胞排列而成的迂曲分支狀胃小凹開口形態(tài)，且不可觀察到紋狀緣”作為不完全型GIM的pCLE下診斷標(biāo)準(zhǔn)，與HE染色診斷（新悉尼系

6、統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)）進(jìn)行比對(duì)，統(tǒng)計(jì)分析pCLE診斷不同亞型GIM與HE染色診斷的一致性。
　　2.共聚焦激光顯微內(nèi)鏡在胃癌分子成像中的研究主要包括細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。通過蛋白印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩株人胃癌細(xì)胞系MGC-803和NCI-N87中HER2表達(dá)量情況;通過流式細(xì)胞術(shù)和細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)熒光基團(tuán)標(biāo)記的抗HER2抗體作為分子探針是否可特異性結(jié)合到HER2高表達(dá)的細(xì)胞系上;通過細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)所用濃度的抗HER2抗體和對(duì)照抗體對(duì)細(xì)

7、胞毒性有無差異;通過構(gòu)建荷瘤鼠模型以及在荷瘤鼠模型上進(jìn)行的活體熒光實(shí)驗(yàn)、pCLE成像實(shí)驗(yàn)，由兩位富有經(jīng)驗(yàn)的pCLE內(nèi)鏡醫(yī)師對(duì)pCLE成像結(jié)果進(jìn)行半定量化，即分級(jí)為-、+、2+、3+、4+，并進(jìn)行皮下瘤和肝臟的HE染色及免疫組化實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)以熒光基團(tuán)標(biāo)記的抗HER2抗體作為分子探針，利用pCLE是否可以鑒別出HER2高表達(dá)的荷瘤鼠。
　　結(jié)果:
　　1.共聚焦激光顯微內(nèi)鏡在胃癌及癌前病變?cè)\斷中的作用研究共納入55例患者，以胃黏膜

8、病變例數(shù)為基礎(chǔ)，共計(jì)80個(gè)胃黏膜病變。以病理組織學(xué)診斷結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，pCLE診斷AG的靈敏度、特異度及相應(yīng)95％CI分別為81.25％(95％CI，53.69％-95.03％)、98.44％(95％CI，90.46％-99.92％)，符合率為95.00％，κ值為0.84; pCLE診斷GIM的靈敏度、特異度及相應(yīng)95％CI分別為93.22％(95％CI，82.73％-97.81％)、90.48％(95％CI，68.17％-98.33％)

9、，符合率為92.50％，κ值為0.81; pCLE和HE染色診斷完全型GIM的符合率為0.75，κ值為0.49，診斷不完全型GIM的符合率為0.79，κ值為0.48; pCLE診斷LGIN（金標(biāo)準(zhǔn):病理診斷為輕度、中度或輕中度異型增生）的靈敏度、特異度及相應(yīng)95％CI分別為82.35％(95％CI，55.80％-95.33％)、88.89％(95％CI，77.84％-95.04％)，符合率為87.50％，κ值為0.66; pCLE診斷H

10、GIN（金標(biāo)準(zhǔn):病理診斷為重度異型增生或胃癌）的靈敏度、特異度及相應(yīng)95％CI分別為95.65％（95％CI，76.03％-99.77％）、98.25％(95％CI，89.37％-99.91％)，符合率為97.50％，κ值為0.94。
　　2.共聚焦激光顯微內(nèi)鏡在胃癌分子成像中的研究蛋白印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果為MGC-803低表達(dá)HER2，而NCI-N87高表達(dá)HER2;流式細(xì)胞術(shù)和細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果為熒光基團(tuán)標(biāo)記的抗HER2抗體作為分子

11、探針可以特異性結(jié)合到HER2高表達(dá)的細(xì)胞系上;細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示實(shí)驗(yàn)用抗體濃度實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組對(duì)細(xì)胞毒性相近，不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的解讀;MGC-803荷瘤鼠和NCI-N87荷瘤鼠構(gòu)建成功，活體熒光成像實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明每只荷瘤鼠尾靜脈注射4μg熒光基團(tuán)標(biāo)記的抗HER2抗體、避光飼養(yǎng)24小時(shí)可清楚觀測(cè)到皮下瘤熒光量間的差異;pCLE成像實(shí)驗(yàn)半定量化結(jié)果為NCI-N87荷瘤鼠尾靜脈注射熒光標(biāo)記的抗HER2抗體中的8只為3+或4+，1只2+，

12、尾靜脈注射熒光標(biāo)記的對(duì)照抗體均在2+及以下，免疫組化結(jié)果均為HER2過表達(dá);MGC-803荷瘤鼠尾靜脈注射熒光標(biāo)記的抗HER2抗體中有3只為4+，免疫組化結(jié)果也均為HER2過表達(dá)，其余5只為2+及以下，免疫組化結(jié)果為其中1只為HER2過表達(dá);MGC-803荷瘤鼠尾靜脈注射熒光標(biāo)記的對(duì)照抗體均在2+及以下，免疫組化結(jié)果均為HER2低表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　pCLE可用于診斷AG、GIM、LGIN、HGIN，并可對(duì)GIM進(jìn)行初步

13、分型診斷。
　　以熒光基團(tuán)標(biāo)記的抗HER2抗體作為分子探針，利用pCLE的分子成像功能，可以很好地鑒別出HER2過表達(dá)的胃癌細(xì)胞和荷瘤鼠。
　　意義:
　　本研究結(jié)果表明pCLE可用于診斷AG、GIM、LGIN、HGIN以及對(duì)GIM進(jìn)行初步分型診斷，為pCLE的臨床應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持，并可以指導(dǎo)內(nèi)鏡醫(yī)師利用pCLE診斷結(jié)果進(jìn)行靶向活檢，以提高檢出率，降低漏診率。
　　本研究通過細(xì)胞系和動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)首次闡明了pCLE