控制性促排卵黃體期添加雌激素對子宮內(nèi)膜容受性影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、1.研究背景：不孕癥(Infertility)發(fā)病率約占育齡婦女的10~15％,是影響家庭乃至社會和諧與穩(wěn)定的重要因素之一。受孕成功的四大因素是:高質(zhì)量的卵子和精子、通暢的輸卵管和良好的子宮內(nèi)膜,四者缺一不可。其中子宮內(nèi)膜是胚胎種植的“土壤”,良好的子宮內(nèi)膜環(huán)境是受孕成功的關(guān)鍵。所以,子宮內(nèi)膜容受性(Endometrialreceptivity)是目前生殖領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。
　　正常子宮內(nèi)膜僅在一特定時(shí)期允許著床,這一時(shí)期子宮內(nèi)膜容

2、受性最高,稱為著床窗口期(Window of implantation),一般為排卵后6~10d,即正常月經(jīng)周期的19~24d。子宮內(nèi)膜容受性的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)包括子宮內(nèi)膜厚度、形態(tài)、母體內(nèi)分泌狀況和子宮內(nèi)膜的生殖調(diào)控因子,包括細(xì)胞形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)和基因水平的研究,如:胞飲突(pinopode,pp)、白血病抑制因子(Leukaemia inhibitory factor,LIF)、整合素家族(Integrins)、白細(xì)胞介素1(IL-1)、

3、表皮生長因子(EGF)、集落刺激因子(CSF-1)、雌孕激素受體等。
　　控制性促排卵(Contral Ovarian Stimulation,COS)體外受精-胚胎移植(InVitro Fertilization and Embryo Transfer,IVF-ET)技術(shù)已較廣泛地用于治療難治性不孕癥,其臨床妊娠成功率受諸多因素的影響。如何提高其胚胎種植率和臨床妊娠率是一個亟待解決的難題。子宮內(nèi)膜容受性與胚胎質(zhì)量是影響IVF-E

4、T成功率的兩大主要因素。而胚胎著床前子宮內(nèi)膜的容受狀態(tài)受雌、孕激素及生殖調(diào)控因子的協(xié)同調(diào)節(jié)。在IVF-ET控制性促排卵中大多數(shù)應(yīng)用促性腺激素釋放激素協(xié)同劑(Gonadotropicreleasingllormoneagonist,GnRHa)進(jìn)行降調(diào)節(jié),通過抑制內(nèi)源性的促黃體生成素(Lutenizing Hormone,LH)峰的出現(xiàn),使多個卵泡募集,獲得多個高質(zhì)量的卵子,與精子結(jié)合形成多個胚胎,選擇優(yōu)秀的胚胎進(jìn)行移植,從而提高妊娠成功

5、率,改善妊娠結(jié)局。但是,這種抑制作用可使排卵后黃體期的LH分泌也受到抑制,導(dǎo)致黃體功能不足,胚胎種植率和妊娠率的降低。
　　對接受控制性促排卵WF-ET患者進(jìn)行黃體支持已得到大家的公認(rèn)。傳統(tǒng)的黃體支持方法是黃體期應(yīng)用黃體酮(Progesterone,p),如何改進(jìn)黃體期支持方案增加子宮內(nèi)膜容受性以提高胚胎種植率和WF-ET妊娠成功率是近年來生殖領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。近來有學(xué)者試著在傳統(tǒng)方案的基礎(chǔ)上添加小劑量雌激素,但只是在初步探索階段,

6、尚無確切的定論。到目前為止,有關(guān)黃體期支持添加雌激素與子宮內(nèi)膜容受性關(guān)系的研究,報(bào)道甚少,尚未見運(yùn)用細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫組化、分子生物學(xué)手段及臨床資料統(tǒng)計(jì)分析聯(lián)合證實(shí)黃體期添加雌激素對子宮內(nèi)膜容受性影響的研究。
　　2.研究目的：為探討COS黃體期支持添加小劑量雌激素對子宮內(nèi)膜容受性的影響,本課題首先通過建立動物模型,采用細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫組化和分子生物學(xué)技術(shù),觀察不同COS黃體期支持方案小鼠子宮內(nèi)膜胞飲突、LIF和LIFmRNA的表達(dá)

7、,從而總結(jié)添加雌激素對小鼠子宮內(nèi)膜容受性的影響。在此基礎(chǔ)上,對臨床進(jìn)行控制性促排卵IVF-ET的患者進(jìn)行回顧性分析,觀察其胚胎移植(Embryo transfer,ET)日血清雌二醇(Estradiol,E2)水平較注射絨毛膜促性腺激素(hCG)日下降幅度對人胚胎種植率和臨床妊娠率的影響,進(jìn)而對臨床接受控制性促排卵IVF-ET患者采用不同方案進(jìn)行黃體期支持,對各組患者IVF-ET實(shí)驗(yàn)室和臨床資料進(jìn)行研究分析,探討ET日E2下降幅度對人胚

8、胎種植率和臨床妊娠率的影響及黃體期支持添加雌激素的必要性。通過系列研究,深入探討雌激素與子宮內(nèi)膜容受性關(guān)系的內(nèi)在分子機(jī)制,從而揭示控制性促排卵黃體期支持添加雌激素對子宮內(nèi)膜容受性的影響,為改進(jìn)臨床治療方案、提高IVF-ET技術(shù)妊娠成功率提供一定的理論依據(jù)。
　　3.材料與方法：3.1動物實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1.1分組方法:將正常雌性小鼠隨機(jī)分為四組:A組、B組和C組均采用控制性促排卵,用hCG后分別與正常雄性小鼠2:1合籠,次日清晨

9、檢查陰栓,有陰栓者為受孕第1d;D組:自然周期組,與正常雄性小鼠2:1合籠,次日清晨檢查陰栓,有陰栓者為受孕第1d。3.1.2用藥方法:控制性促排卵的雌性小鼠從受孕第1d開始接受不同的黃體期支持方法:A組:不采用黃體期藥物支持;B組:單用黃體酮進(jìn)行黃體期支持;C組:在應(yīng)用黃體酮的基礎(chǔ)上添加雌激素;D組:同時(shí)應(yīng)用同等量的生理鹽水。3.1.3取材:A、B、C、D組小鼠分別于孕第3、4、5d剖腹取子宮。3.1.4掃描電鏡(scanning e

10、lectronic microscopy,SEM)觀察各組受孕小鼠圍植入期胞飲突的表達(dá)。3.1.5采用免疫組化(Immunohistochemistry,SP)法檢測LIF蛋白在各組受孕小鼠圍植入期子宮內(nèi)膜的表達(dá)情況。3.1.6采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse transcriptional-polymerise chain reaction,RT-PCR)法檢測LIFmRNA在各組受孕小鼠圍植入期子宮內(nèi)膜的表達(dá)情況。3.2臨床材

11、料與方法3.2.1回顧性分析97個接受長方案控制性超排卵(COS)及IVF-ET治療周期。應(yīng)用電化學(xué)發(fā)光技術(shù)分別測定hCG日和ET日血清雌二醇(E2)水平。根據(jù)ET日血清雌二醇(E2)下降幅度分為6組:組1:12個治療周期,E2下降幅度<20％;組2:13個,E2下降幅度20％~29％;組3:11個周期,E2下降幅度30％~39％;組4:16個周期,E2下降幅度40％~49％;組5:24個周期,E2下降幅度50％~59％;組6:21個周

12、期,E2下降幅度≥60％。觀察ET日血清雌二醇(E2)下降幅度對胚胎種植率和臨床妊娠率的影響。3.2.2為探討雌激素添加是否可以改善IVF-ET的結(jié)局,回顧性分析216個長方案控制性超排卵IVF-ET周期的治療結(jié)果,根據(jù)其黃體期支持用藥情況分為兩組:A1組:97個周期,單用黃體酮進(jìn)行黃體期支持;B1組:119個周期,對移植日血清雌二醇(E2)水平下降幅度≥30％的89個周期采用黃體酮加小劑量雌激素進(jìn)行黃體期支持。3.2.3為了探討雌激素

13、添加的劑量及方案,回顧性分析104個長方案控制性促排卵IVF-ET周期的治療結(jié)果,根據(jù)其移植日血清E2下降幅度黃體期支持添加雌激素的劑量分為四組:A2組:12個周期,單用黃體酮進(jìn)行黃體期支持;B2組:18個周期,移植日血清E2水平較hCG日下降幅度在30％~390,其黃體期支持采用黃體酮加3mg雌激素;C組:16個周期,移植日血清E2水平下降幅度40％~49％;D組:58個周期,移植日血清E2水平下降幅度≥50％;對于C組、D組患者采用

14、黃體酮加4mg雌激素進(jìn)行黃體期支持。3.2.4對比雌激素添加與傳統(tǒng)黃體期支持方案胚胎種植率和臨床妊娠率的差異。3.2.5對比添加不同劑量的雌激素其胚胎種植率和臨床妊娠率的差異。3.3數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,數(shù)值變量采用t檢驗(yàn)或方差分析,分類變量采用卡方檢驗(yàn)或精確概率法檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4.結(jié)果：4.1動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1.1子宮內(nèi)膜胞飲突表達(dá)結(jié)果:B、C、D組小鼠子宮內(nèi)膜孕

15、第3d為發(fā)育中的胞飲突,孕第4d子宮內(nèi)膜表面胞飲突完全發(fā)育,邊界清楚,大小一致,呈蘑菇樣外觀,5d子宮內(nèi)膜可見退化的胞飲突;C和D組較好,B組稍次之。A組于孕3d即可見少量完全發(fā)育的胞飲突,但凸起較小,大小不均,第4d胞飲突開始退化。4.1.2子宮內(nèi)膜LIF蛋白定性表達(dá)結(jié)果:在C、D組受孕小鼠,孕3d腺上皮和腔上皮LIF蛋白表達(dá)水平呈弱陽性著色,孕4d時(shí)LIF蛋白表達(dá)水平顯著上升達(dá)峰值,呈強(qiáng)陽性著色(++),孕5d時(shí)呈陽性著色(+)。B

16、組孕3d腺上皮和腔上皮呈弱陽性著色,孕4d時(shí),LIF蛋白表達(dá)水平呈陽性著色(+),孕5d時(shí)呈弱陽性著色。A組孕3d腺上皮和腔上皮LIF蛋白表達(dá)水平呈陽性著色(+),孕4d和5d時(shí)呈弱陽性著色。4.1.3子宮內(nèi)膜LIF蛋白半定量表達(dá)結(jié)果:圖像分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果顯示小鼠C、D組受孕第3、4、5d子宮內(nèi)膜LIF蛋白的表達(dá)水平均明顯高于A組(P<0.05);B組第3、4、5d子宮內(nèi)膜LIF蛋白的表達(dá)水平高于A組(P<0.05),但明顯低于C、

17、D組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。D組與C組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。4.1.4子宮內(nèi)膜LIF mRNA表達(dá)組內(nèi)比較結(jié)果:B、C、D組孕鼠子宮內(nèi)膜LIFmRNA表達(dá)均為陽性,A組孕鼠LIF mRNA的表達(dá)極弱。半定量分析表明:組內(nèi)比:B、C、D組受孕小鼠均于孕4d時(shí)LIF蛋白表達(dá)水平達(dá)峰值,而A組于孕3d腺上皮和腔上皮LIF蛋白表達(dá)水平最高,孕4d和5d時(shí)較低。4.1.5 LIF mRNA表達(dá)各組間比較結(jié)果:各組小鼠子宮內(nèi)膜LIF mRN

18、A表達(dá)半定量分析組間比結(jié)果:小鼠C、D組明顯高于A組;B組高于A組(P<0.05),但明顯低于C、D組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。C組與D組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。4.1.6 LIF mRNA表達(dá)高峰期比較結(jié)果:B、C、D組小鼠孕4d與A組孕3天相比,其子宮內(nèi)膜胞飲突表達(dá)、腺上皮和腔上皮LIF蛋白表達(dá)、LIF mRNA表達(dá)結(jié)果:C和D組最好,B組稍次之,A組最差。LIF蛋白圖像分析、LIF mRNA半定量分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果顯示:小鼠

19、C、D組明顯高于A組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);B組高于A組(P<0.05),但明顯低于C、D組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P<0.05);C組與D組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。4.2臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.2.1 ET日血清E2水平均呈不同程度的下降。4.2.2當(dāng)ET日血清E2水平下降幅度≥30％時(shí)胚胎種植率和妊娠率明顯降低,差異出現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。4.2.3其中下降幅度≥30％者占總周期數(shù)的74.23％。4.2.4年齡大的患者其下降幅度偏

20、大,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。4.2.5各組參數(shù)比較結(jié)果:A1組與B1組的取卵數(shù)目、受精率、卵裂率、人絨毛膜促性腺激素(hCG)日E2水平、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、內(nèi)膜厚度和移植胚胎數(shù)目相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);A2組、B2組、C組、D組的取卵數(shù)目、受精率、卵裂率、人絨毛膜促性腺激素(HCG)日E2水平、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、內(nèi)膜厚度和移植胚胎數(shù)目相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)4.2.6 A1組與B1組結(jié)果比較:A1組當(dāng)胚胎移植日血清E2下降幅度≥3

21、0％時(shí),胚胎種植率和臨床妊娠率下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);B1組當(dāng)E2下降幅度≥40％時(shí),胚胎種植率和臨床妊娠率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);說明給予3mg/d戊酸雌二醇補(bǔ)充改善了E2下降幅度在30~40％的患者,而下降幅度≥40％的患者需較大量的雌激素補(bǔ)充。兩組整體相比,B1組胚胎種植率明顯高于A1組(P<0.05),妊娠率亦高于A1組,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.15)。4.2.8添加不同劑量雌激素結(jié)果比較:根據(jù)E2下降