JWA和MAPK在As-,2-O-,3-和TPA誘導(dǎo)MCF-7和HeLa細胞分化及凋亡中的作用機制研究.pdf

1、絲裂原活化蛋白激酶信號通路(mitogen-activatedproteinkinase,MAPK)是不同的分裂、增生、凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的匯集點，該信號通路也存在于造血系統(tǒng)腫瘤、上皮發(fā)生腫瘤的發(fā)生發(fā)展中。在哺乳動物細胞中研究較多的主要有ERK、JNK、p38三條信號通路。一般認為，JNK和p38通路與凋亡發(fā)生、炎癥反應(yīng)等有關(guān)，而ERK信號通路主要調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化，并抑制凋亡的發(fā)生。針對MAPK信號通路的小分子抑制劑的發(fā)現(xiàn)使人們有可能

2、利用已發(fā)現(xiàn)的細胞分子生物學(xué)的理論和機制指導(dǎo)開發(fā)新的治療方法。越來越多的臨床前研究證實MEK抑制劑能增強傳統(tǒng)化療藥物的療效。近十多年來的研究顯示，三氧化二砷(arsenictrioxide，As2O3)對新確診的和復(fù)發(fā)的急性早幼粒白血病(acutepromyelocyticleukemia,APL)病人有顯著的療效。最近，大量的體內(nèi)和體外實驗證明，As2O3對部分實體瘤也有顯著的療效。As2O3的作用機制復(fù)雜，在白血病細胞中主要通過作用于

3、PML-RARα和PML蛋白而誘導(dǎo)分化和凋亡。最近的研究顯示，As2O3還可能作用于廣泛的細胞信號通路而誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。但是，As2O3誘導(dǎo)實體瘤細胞凋亡的機制還不完全清楚。As2O3可以激活MAPK信號通路，并且由于特定細胞的組織起源和特異性不同而有所差異。我們的預(yù)試驗結(jié)果也顯示As2O3誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細胞凋亡過程中ERK1/2的活性明顯升高，并呈劑量效應(yīng)關(guān)系。As2O3對多數(shù)實體瘤的顯著凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)的濃度一般在2μM以上，遠

4、遠高于對APL細胞的凋亡誘導(dǎo)濃度(0.5μM)。因此探討MEK抑制劑與As2O3聯(lián)合運用以降低As2O3的使用濃度，從而達到增強療效和降低毒性的研究具有重要的意義。另外，JNK和p38通路在As2O3誘導(dǎo)實體瘤細胞凋亡中的作用也有待闡明。 JWA基因(AF070523.1)是周建偉等1998年發(fā)現(xiàn)并克隆的受維甲酸誘導(dǎo)的新基因。通過對其結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，JWA基因cDNA包含2088個核苷酸，編碼188個氨基酸，其啟動子序列中含有多種

5、反應(yīng)元件，如TPA(12-O-tetradecanoyl-phorbol-13acetate)反應(yīng)元件(TRE)、hemin反應(yīng)元件(HRE)、熱休克反應(yīng)元件(hRE)、應(yīng)激反應(yīng)元件(SRE)和ATRA反應(yīng)元件(ARE)半位點等。在JWA編碼蛋白中有兩個含絲氨酸殘基的PKC(proteinkinaseC)磷酸化位點(SDR-SLR)。課題組前期的研究證實，JWA不僅廣泛地參與調(diào)節(jié)多種分化和/或凋亡誘導(dǎo)劑(如TPA，ATRA，4HPR和A

6、s2O3)涉及的信號通路，而且活躍地參與細胞對應(yīng)激刺激(如氧化應(yīng)激和熱應(yīng)激)的應(yīng)答。但是JWA參與調(diào)節(jié)細胞分化/凋亡作用中的具體機制尚不明確。作為不同的分裂、增生、凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的匯集點的MAPK信號通路與JWA是否存在交互作用，它們在信號通路中的上下游關(guān)系如何?活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)與細胞凋亡密切相關(guān)，化學(xué)誘導(dǎo)劑(如As2O3)是否通過H2O2調(diào)節(jié)JWA?TPA作為PKC激動劑是否通過磷酸化JW

7、A蛋白的PKC位點而誘導(dǎo)細胞分化?這些都是本課題關(guān)心的問題。因此，本課題準備一方面對MAPK信號通路(ERK、JNK、p38)在As2O3誘導(dǎo)實體瘤細胞凋亡中的機制作初步探討，為MEK抑制劑和As2O3聯(lián)合運用提高As2O3對實體瘤的療效提供理論和實驗依據(jù)；另一方面對JWA參與調(diào)控細胞分化、凋亡的機制作進一步研究，為闡明JWA的結(jié)構(gòu)、功能及其相互關(guān)系提供實驗依據(jù)。 本課題選擇兩種實體瘤細胞株MCF-7和HeLa，利用As2O3作

8、為凋亡誘導(dǎo)劑，研究MAPK信號通路(ERK、p38和JNK)在As2O3誘導(dǎo)的細胞凋亡中的作用；著重探討了MEK抑制劑對As2O3誘導(dǎo)凋亡的增強作用及其機制；利用構(gòu)建的JWA低表達MCF-7和HeLa細胞，研究JWA對As2O3誘導(dǎo)的細胞生長抑制、細胞凋亡和DNA損傷等的影響；初步探討了JWA和ROS、MAPK信號通路的關(guān)系；利用PCR引入突變法構(gòu)建JWA編碼蛋白中兩個PKC磷酸化位點(SDR-SLR)突變的載體，初步研究TPA誘導(dǎo)MC

9、F-7細胞分化中JWA的作用機制。結(jié)果表明： 1.MAPK信號通路對As2O3誘導(dǎo)MCF-7和HeLa細胞凋亡有重要調(diào)節(jié)作用 在人乳腺癌MCF-7細胞中，As2O3能誘導(dǎo)細胞生長抑制(MTT分析結(jié)果)，并呈劑量-效應(yīng)和時間-效應(yīng)關(guān)系。As2O3作用24，48和96h的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為8.6，3.3和1.86μM。Hoechst33258染色后熒光顯微鏡觀察以及AnnexinV-PI雙染后流式細胞儀檢測證實A

10、s2O3能誘導(dǎo)細胞凋亡。As2O3能激活MCF-7細胞中MEK/ERK信號通路，而該通路的激活可能削弱As2O3的作用效果。因此我們進一步研究As2O3和MEK抑制劑聯(lián)合作用是否能增強MCF-7細胞的生長抑制和凋亡。MEK抑制劑U0126(10μM)或者PD98059(20μM)與As2O3(2，5μM)聯(lián)合作用后顯著增強MCF-7細胞的生長抑制作用(MTT法和3H摻入法)。進一步的研究結(jié)果顯示，U0126或者PD98059與As2O3

11、聯(lián)合作用能顯著增強MCF-7細胞的凋亡(Hoechst33258染色，熒光顯微鏡觀察，和AnnexinV/PI染色，流式細胞儀檢測)。另外，As2O3也能劑量依賴地激活p38，但是不激活JNK。p38抑制劑處理不能抑制誘導(dǎo)的細胞凋亡，但MEK抑制劑能增強As2O3誘導(dǎo)的MCF-7細胞凋亡。 在人宮頸癌HeLa細胞中，As2O3能劑量依賴地誘導(dǎo)HeLa細胞凋亡(Hoechst33258染色)。以1、2、5μMAs2O3處理HeLa

12、細胞24h，其凋亡率分別為5﹪、16.7﹪、27.5﹪。As2O3能劑量依賴地激活(磷酸化)ERK、p38、JNK(Westernblot檢測)。同時也能檢測到Bad的磷酸化。已知，Bad作為Bcl-2家族中促凋亡成員之一，能將與Bcl-2或Bcl-xL結(jié)合的Bax替換出來，促進凋亡的發(fā)生。Bad在Ser112的磷酸化可抑制Bad與Bcl-2和Bcl-xL的結(jié)合。MEK抑制劑PD98059(20μM)處理后，能顯著增強As2O3所誘導(dǎo)的

13、細胞凋亡，同時As2O3所致的ERK磷酸化和Bad磷酸化被抑制。JNK抑制劑SP600125(10μM)處理后，則顯著抑制As2O3所誘導(dǎo)的細胞凋亡。p38抑制劑對As2O3所誘導(dǎo)的細胞凋亡無顯著影響。實驗結(jié)果提示，ERK信號通路在As2O3誘導(dǎo)的HeLa細胞凋亡中起負調(diào)控作用，MEK抑制劑和As2O3聯(lián)合作用能增強HeLa細胞凋亡，Bad去磷酸化可能是MEK抑制劑的作用機制；JNK在As2O3誘導(dǎo)的HeLa細胞凋亡中起正調(diào)控作用。JN

14、K激活狀態(tài)在兩種實體瘤細胞MCF-7和HeLa中的不一致性，可能是由于細胞類型的不同所致。 2.JWA在As2O3誘導(dǎo)的細胞生長抑制、DNA損傷和細胞凋亡中的作用 As2O3處理MCF-7和HeLa細胞后，Westernblot檢測JWA蛋白表達水平呈劑量依賴性升高。利用構(gòu)建的JWA基因反義RNA真核表達載體pEGFP-C1-asJWA，經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染MCF-7和HeLa細胞，G418篩選獲得JWA低表達的穩(wěn)定細胞株asJ

15、WA-MCF-7和asJWA-HeLa，同時以pEGFP-C1轉(zhuǎn)染并篩選獲得表達空載體的穩(wěn)定細胞株C1-MCF-7和C1-HeLa。As2O3(2，5，10μM)處理C1-MCF-7和asJWA-MCF-7細胞，分別以MTT法、彗星試驗、Hoechst染色(和/或流式細胞儀)檢測細胞的生長抑制、DNA損傷和細胞凋亡。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，As2O3能劑量依賴地誘導(dǎo)C1-MCF-7細胞的生長抑制、DNA損傷和細胞凋亡，而對asJWA-MCF-7細胞，

16、As2O3誘導(dǎo)的生長抑制、DNA損傷和細胞凋亡作用減弱。As2O3(1，2，5μM)處理C1-HeLa和asJWA-HeLa細胞時，出現(xiàn)相似的情況，即與C1-HeLa相比，As2O3誘導(dǎo)asJWA-HeLa細胞生長抑制、DNA損傷和細胞凋亡作用減弱。這些結(jié)果說明JWA在As2O3誘導(dǎo)的細胞生長抑制、DNA損傷和細胞凋亡中起正調(diào)控的作用，提示JWA可能發(fā)揮類似抑癌基因的作用。 3.JWA和ROS、MAPK信號通路的關(guān)系及其在As2

17、O3誘導(dǎo)的細胞凋亡中的作用 為觀察JWA和ROS的關(guān)系，我們利用DCFH-DA染色方法，在熒光顯微鏡下檢測到As2O3誘導(dǎo)HeLa細胞凋亡過程中ROS顯著增加，Westernblot檢測到JWA表達水平升高；進一步，使用過氧化氫酶(catalase)可以抑制As2O3誘導(dǎo)的ROS的產(chǎn)生，說明這種ROS是以過氧化氫的形式存在。ROS被過氧化氫酶抑制后，JWA表達水平也受到抑制，同時細胞凋亡率顯著下降。這些結(jié)果提示：ROS在As2O