蛋白質組學在多發(fā)性硬化與視神經(jīng)脊髓炎血清和腦脊液中的研究.pdf

1、研究背景:
　　 多發(fā)性硬化(Multiple sclerosis,MS)及視神經(jīng)脊髓炎(Neuromyelitis optica,NMO)均是病因不明的中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫性脫髓鞘疾病,病理過程主要是脫髓鞘改變,臨床表現(xiàn)依中樞神經(jīng)系統(tǒng)累及的部位不同而呈現(xiàn)多樣化。
　　 多發(fā)性硬化及視神經(jīng)脊髓炎雖同屬中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘病,但兩者在發(fā)病機制、病理表現(xiàn)、臨床特點、治療方案等方面有諸多不同,尤其是在NMO患者血清中發(fā)現(xiàn)自身抗體NM

2、O-IgG后,目前更傾向NMO并非是MS的一種亞型而是一個獨立的疾病。但由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織標本的不易獲取,阻礙了對MS及NMO病理機制的進一步研究,而體液作為內環(huán)境的重要組成部分,其所含有的多肽、蛋白質和酶類在生理過程中起到非常重要的作用,其蛋白與多肽的質和量的變化,能精確反映機體疾病狀態(tài)下的病理生理過程,MS及NMO復雜的免疫應答引起腦脊液、血清、腦組織、各種亞細胞器中蛋白質種類和數(shù)量的動態(tài)變化。鑒于此,可以通過研究MS和NMO血清

3、及腦脊液中特定蛋白的變化,獲得反應疾病的發(fā)生、進展、以及機體對疾病產(chǎn)生的代償機制如神經(jīng)保護、組織重塑、炎癥反應等信息。
　　 蛋白質組(Proteome)概念的內容主要包括對全蛋白質的定性、定量和從功能角度分析大量蛋白質,這是一個整體的、動態(tài)的概念。蛋白質組學(Proteomics)是指根據(jù)蛋白質種類、數(shù)量、局部存在的時間、空間上的變化來研究表達于細胞、組織及個體中的全部蛋白質(proteome),并從其結構和功能的角度綜合分析

4、生命活動的一門科學。蛋白質組學研究最顯著的特點是能對生理與病理狀態(tài)下的體液、組織或細胞中蛋白質組分進行大通量的綜合分析,這有助于對復雜多變的神經(jīng)系統(tǒng)疾病進行較為全面的認識。
　　 本實驗即對MS及NMO患者的血清和腦脊液進行蛋白質組學研究,進行蛋白分離、蛋白鑒定,分析探討MS、NMO各自的血清和腦脊液蛋白組學特點以及行兩者之間的比較研究,以期深入探討兩者的病理機制,并對MS、NMO的診斷及兩者的鑒別診斷提供一定的輔助依據(jù)。

5、>　　 第一部分 MS患者血清和腦脊液的蛋白質組學研究.
　　 目的:
　　 建立MS血清和腦脊液2D電泳圖譜,分別觀察MS與正常對照組血清和腦脊液2D電泳的表達差異；對差異表達的蛋白進行鑒定,并探討其意義。
　　 方法:
　　 1.采集MS組和正常對照組血清和腦脊液,進行全蛋白提取、Bradford法蛋白定量。
　　 2.分別將血清和腦脊液樣品均等份混合后重復跑2D電泳三遍,第一向為等電凝聚凝

6、膠電泳,第二向為SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。
　　 3.硝酸銀染法染后,并應用ImageMaster2D Platinum5.0軟件對圖像進行分析。
　　 4.分別比較血清和腦脊液結果,選擇兩組間感興趣的蛋白點(兩組2D電泳圖譜中點體積百分比差異兩倍以上或者具有有無差異的點)切膠取樣、酶解消化,以高敏度HD—ms／ms質譜分析進行蛋白鑒定。
　　 5.利用MASCOT在線軟件進行檢索蛋白質。
　　 結果:<

7、br>　　 (一)血清結果.
　　 1.MS組血清2D電泳凝膠圖譜共獲得414個蛋白點,正常對照組血清2D電泳凝膠圖譜共獲得476個蛋白點。
　　 2.MS組與正常對照組血清2D電泳凝膠圖譜相比,匹配蛋白點為345個,MS組相比正常組表達上調的蛋白點159個,其中上調差異大于2倍以上的蛋白點42個,表達下調的蛋白點186個。兩組未匹配的蛋白點,MS組69個,正常對照組131個。
　　 3.MS組血清2D電泳凝膠

8、圖譜與正常對照組相比未表達的蛋白點共81個。
　　 4.通過HD—ms／ms質譜分析和MASCOT網(wǎng)絡檢索,鑒定兩個差異蛋白質:免疫球蛋白九和角蛋白83,前者僅見于多發(fā)性硬化血清2D凝膠圖譜,后者在MS組中的表達比正常對照組差異遠大于2倍。
　　 (二)腦脊液結果.
　　 1.MS組CSF2D電泳凝膠圖譜共獲得118個蛋白點,正常對照組CSF的2D電泳凝膠圖譜共獲得350個蛋白點。
　　 2.MS組與正常

9、對照組CSF2D電泳凝膠圖譜相比,匹配蛋白點為51個,MS組相比正常組表達上調的蛋白點38個,其中上調差異大于2倍以上的蛋白點24個,表達下調的蛋白點13個。兩組未匹配的蛋白點,MS組67個,正常對照組299個。
　　 3.通過HD—ms／ms質譜分析和MASCOT網(wǎng)絡檢索,鑒定三個差異蛋白質:前白蛋白、角蛋白1和角蛋白9,前白蛋白僅見于多發(fā)性硬化CSF的2D凝膠圖譜,角蛋白1在MS組無表達而在正常對照組有表達,角蛋白9在MS組

10、中的表達比正常對照組差異遠大于2倍。
　　 結論:
　　 1.多發(fā)性硬化患者與正常對照組血清2D凝膠電泳圖譜對比有多種蛋白質表達呈顯著差異。
　　 2.鑒定了兩個血清差異表達蛋白免疫球蛋白九(Ig lamda chain)和角蛋白83(keratin83)。免疫球蛋白λ高表達可能與MS的免疫機制相關。
　　 3.發(fā)性硬化患者與正常對照組CSF的2D凝膠電泳圖譜對比有多種蛋白質表達呈顯著差異。
　　

11、 4.鑒定了三個腦脊液差異表達蛋白前白蛋白、角蛋白1和角蛋白9。
　　 第二部分 NMO患者血清和腦脊液的蛋白質組學研究。
　　 目的:
　　 建立NMO血清和腦脊液2D電泳圖譜,分別觀察NMO與正常對照組血清和腦脊液2D電泳的表達差異；對差異表達的蛋白進行鑒定,并探討其意義。
　　 方法:
　　 1.采集NMO組和正常對照組血清和腦脊液,進行全蛋白提取、Bradford法蛋白定量。
　　

12、 2.分別將血清和腦脊液樣品均等份混合后重復跑2D電泳三遍,第一向為等電凝聚凝膠電泳,第二向為SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。
　　 3.硝酸銀染法染后,并應用ImageMaster2D Platinum5.0軟件對圖像進行分析。
　　 4.分別比較血清和腦脊液結果,選擇兩組間感興趣的蛋白點(兩組2D電泳圖譜中點體積百分比差異兩倍以上或者具有有無差異的點)切膠取樣、酶解消化,以高敏度HD—ms／ms質譜分析進行蛋白鑒定。

13、>　　 5.利用MASCOT在線軟件進行檢索蛋白質。
　　 結果:
　　 (一)血清結果
　　 1.NMO組血清2D電泳凝膠圖譜共獲得472個蛋白點,正常對照組血清2D電泳凝膠圖譜共獲得476個蛋白點。
　　 2.NMO組與正常對照組血清2D電泳凝膠圖譜相比,匹配蛋白點為374個,NMO組相比正常組表達上調的蛋白點175個,其中上調差異大于2倍以上的蛋白點57個,表達下調的蛋白點199個。兩組未匹配的蛋

14、白點,NMO組98個,正常對照組102個。
　　 3.NMO組血清2D電泳凝膠圖譜與正常對照組相比未表達的蛋白點共52個。
　　 4.通過HD—ms／ms質譜分析和MASCOT網(wǎng)絡檢索,鑒定一個差異蛋白質:觸珠蛋白Hp2,在NMO組中的表達比正常對照組差異遠大于2倍。
　　 (二)腦脊液結果。
　　 1.NMO組CSF2D電泳凝膠圖譜共獲得155個蛋白點,正常對照組CSF2D電泳凝膠圖譜共獲得350個蛋白

15、點。
　　 2.NMO組與正常對照組CSF2D電泳凝膠圖譜相比,匹配蛋白點為82個,NMO組相比正常組表達上調的蛋白點64個,其中上調差異大于2倍以上的蛋白點47個,表達下調的蛋白點18個。兩組未匹配的蛋白點,NMO組73個,正常對照組268個。
　　 3.通過HD—ms／ms質譜分析和MASCOT網(wǎng)絡檢索,鑒定三個差異蛋白質:角蛋白1、角蛋白9和轉鐵蛋白,三者在NMO組中的表達均比正常對照組差異遠大于2倍。
　　

16、 結論:
　　 1.NMO患者與正常對照組血清2D凝膠電泳圖譜對比有多種蛋白質表達呈顯著差異。
　　 2.鑒定了一個血清差異表達蛋白為觸珠蛋白。觸珠蛋白的高表達提示其在NMO免疫反應中可能發(fā)揮一定免疫調節(jié)作用。
　　 3.NMO患者與正常對照組CSF的2D電泳圖譜對比有多種蛋白質表達呈顯著差異。
　　 4.鑒定了三個腦脊液差異表達蛋白細胞轉鐵蛋白、角蛋白9、角蛋白1。
　　 5.轉鐵蛋白的腦脊液

17、高表達可能與NMO患者血腦屏障受損相關,可能是NMO病理過程中BBB受損嚴重的一個反應指標。
　　 第三部分 MS與N]Mo患者血清和腦脊液的蛋白質組學研究。
　　 目的:
　　 分別比較MS與NMO患者血清和腦脊液2D電泳的表達差異；對差異表達的蛋白進行鑒定,并探討其意義。
　　 方法:
　　 1.采集MS組與NMO組血清和腦脊液,進行全蛋白提取、Bradford法蛋白定量。
　　 2.

18、分別將血清和腦脊液樣品均等份混合后重復跑2D電泳三遍,第一向為等電凝聚凝膠電泳,第二向為SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。
　　 3.硝酸銀染法染后,并應用ImageMaster2D Platinum5.0軟件對圖像進行分析。
　　 4.分別比較血清和腦脊液結果,選擇兩組間感興趣的蛋白點(兩組2D電泳圖譜中點體積百分比差異兩倍以上或者具有有無差異的點)切膠取樣、酶解消化,以高敏度HD—ms／ms質譜分析進行蛋白鑒定。
　　

19、 5.利用MASCOT在線軟件進行檢索蛋白質。
　　 結果:
　　 (一)血清結果。
　　 1.MS組血清2D電泳凝膠圖譜共獲得414個蛋白點,NMO組血清2D電泳凝膠圖譜共獲得472個蛋白點。
　　 2.正常組血清有表達且同時在MS組血清有表達而在NMO組血清無表達的蛋白點為52個,正常組血清有表達且同時在NMO組血清有表達而在MS組血清無表達的蛋白點為81個。
　　 3.通過HD—ms／ms

20、質譜分析和MASCOT網(wǎng)絡檢索,鑒定二個差異蛋白質:角蛋白83和觸珠蛋白Hp2。角蛋白83和觸珠蛋白Hp2,兩者在MS組和NMO組中均有表達,前者在MS組血清中與NMO組相比表達遠大于2倍,后者在NMO組血清中與MS組表達遠大于2倍。
　　 (二)腦脊液結果
　　 1.MS組CSF2D電泳凝膠圖譜共獲得118個蛋白點,NMO組CSF2D電泳凝膠圖譜共獲得155個蛋白點。
　　 2.正常組CSF有表達且同時在NMO

21、組CSF有表達而在MS組CSF無表達的蛋白點為45個,正常組CSF有表達且同時在NMO組CSF無表達而在MS組CSF有表達的蛋白點為14個。
　　 3.通過HD—ms／ms質譜分析和MASCOT網(wǎng)絡檢索,鑒定二個差異蛋白質:前自蛋白和角蛋白1,前白蛋白在MS組CSF中有表達而在NMO組和正常對照組CSF中無表達；角蛋白1在NMO組CSF中有表達而在MS組CSF中無表達。
　　 結論:
　　 1.MS患者與NMO患