穿心蓮內(nèi)酯抑制動(dòng)脈粥樣硬化及其分子機(jī)制的研究.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化(atcheroscIerosis,AS)的病理改變是以動(dòng)脈內(nèi)膜下酯質(zhì)沉積,伴隨平滑肌細(xì)胞增殖,纖維基質(zhì)成分增加以及炎癥反應(yīng)為特征,并通過(guò)各種生長(zhǎng)因子和活性代謝產(chǎn)物的影響和調(diào)節(jié),刺激泡沫細(xì)胞形成,泡沫細(xì)胞的不斷產(chǎn)生和堆積導(dǎo)致酯質(zhì)條紋,并進(jìn)一步變成纖維帽,逐步形成粥樣硬化性斑塊。 核因子kB(nuclear factor kappaB,NF-κB)最先是從B淋巴細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一種能與免疫球蛋白k輕鏈基因的kB序列特異性結(jié)

2、合的核蛋白因子,現(xiàn)已知kB序列存在于多種基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子中,NF-κB可與相關(guān)基因啟動(dòng)子或增強(qiáng)子特殊kB序列相結(jié)合,調(diào)控多種基因的表達(dá),在體內(nèi)具有非常重要的生物學(xué)功能。 穿心蓮內(nèi)酯(Andrographolide,Andro)是二萜類化合物,但是目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于Andro抗炎作用的分子機(jī)制仍然知之甚少。本實(shí)驗(yàn)室先前的研究工作表明,Andro能夠共價(jià)修飾處于還原狀態(tài)的p50亞基上第62位半胱氨酸,因?yàn)樵摪被嵛挥贜F-κB結(jié)合特

3、定DNA的關(guān)鍵部位,因此Andro的共價(jià)結(jié)合阻斷了NF-κB二聚體與靶基因特定DNA序列的結(jié)合,抑制炎癥介質(zhì)的活化。那么,在動(dòng)脈粥樣硬化形成過(guò)程中,穿心蓮內(nèi)酯是否也通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路的活化,具有抑制動(dòng)脈粥樣硬化性狀的重要作用? 本研究旨在探索：(1)穿心蓮內(nèi)酯對(duì)NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控作用；(2)穿心蓮內(nèi)酯對(duì)NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用：(3)初步篩選靶向抑制NF-κB的小分子化合物本研究分為體外實(shí)驗(yàn)和

4、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)兩部分： 一.體外實(shí)驗(yàn)。探尋穿心蓮內(nèi)酯對(duì)NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控作用,主要包括： (一)采用E-selectin promoter-luciferase熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)探明Andro是否能夠抑制TNF-α引起的NF-κB活性。 (二)用Andro預(yù)處理人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞,再用酯多糖、佛波酯、TNF-α分別刺激細(xì)胞,然后通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)Andro藥物干預(yù)是否可以下調(diào)活化的內(nèi)皮細(xì)胞E-selectin

5、的表達(dá)。 (三)用Andro預(yù)處理小鼠的內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞,再用酯多糖、佛波酯、腫瘤壞死因子分別刺激上述細(xì)胞,然后應(yīng)用組織因子(TF)活性測(cè)定技術(shù)、蛋白免疫印記技術(shù)檢測(cè)Andro是否可以起到下調(diào)活化的內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞組織因子表達(dá)的作用。 (四)應(yīng)用細(xì)胞轉(zhuǎn)染和TF promoter-luciferase熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)以探明Andro調(diào)控組織因子的表達(dá)是通過(guò)調(diào)控哪個(gè)靶位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)的? 二.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。探索穿心蓮內(nèi)酯對(duì)NF-κ

6、B信號(hào)通路的調(diào)控在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用,主要分解為下列實(shí)驗(yàn)： (一)用apoE基因缺陷型(apoE-/-)小鼠以高酯飼料誘導(dǎo)構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型。 (二)利用油紅O染色技術(shù)、H&E染色顯示主動(dòng)脈竇和主動(dòng)脈血管內(nèi)膜酯肪斑塊的面積,血管壁的厚度,評(píng)價(jià)Andro治療在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊酯質(zhì)沉積中的作用。 (三)全程監(jiān)測(cè)小鼠體重,評(píng)價(jià)Andro治療在物質(zhì)代謝中的作用。 (四)分別于藥物治療前后,禁食12小時(shí)后取

7、血檢測(cè)血漿TG,TC,HDL-C,LDL-C水平,評(píng)價(jià)Andro治療對(duì)酯肪代謝的影響。 (五)應(yīng)用電泳遷移率變動(dòng)實(shí)驗(yàn)(EMSA)分析Andro治療對(duì)NF-κB活性的影響。 (六)應(yīng)用定量PCR技術(shù)分析Andro治療對(duì)NF-κB下游與炎癥,增殖及血栓相關(guān)靶基因E-selectin,VCAM-1,TF的mRNA轉(zhuǎn)錄的影響。 (七)利用免疫組化和免疫灰度統(tǒng)計(jì)技術(shù),觀察穿心蓮內(nèi)酯治療對(duì)E-selectin,VCAM-1,

8、TF,fibrin表達(dá)的影響。 本研究的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果表明Andro具有下列作用和功能：(1)抑制NF-κB與E-selectin啟動(dòng)子的結(jié)合,并且這種抑制作用具有時(shí)間依賴性和濃度依賴性；(2)抑制活化內(nèi)皮細(xì)胞E-selectin的表達(dá)；(3)抑制活化內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞組織因子(TF)的表達(dá)；(4)特異性地抑制組織因子啟動(dòng)子NF-κB位點(diǎn)；(5)減輕動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的酯質(zhì)損傷；(6)不影響動(dòng)脈粥樣硬化小鼠的體重和血酯水平；(7)抑

9、制動(dòng)脈粥樣硬化血管組織NF-κB的活性；(8)下調(diào)動(dòng)脈粥樣硬化血管組織:E-selectin,VCAM-1,TF的mRNA水平；(9)下調(diào)E-selectin,VCAM-1,TF,fibrin的蛋白表達(dá)。 從以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出如下結(jié)論：本研究首次明確地證明了穿心蓮內(nèi)酯通過(guò)阻斷NF-κB信號(hào)通路,抑制動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程；并證實(shí)了NF-κB信號(hào)通路在貫穿動(dòng)脈粥樣硬化始終的炎癥中以及在斑塊的穩(wěn)定性和血栓形成方面具重要作用；進(jìn)而證實(shí)了