氧化性低密度脂蛋白和膽固醇對(duì)HepG2細(xì)胞脂肪積累及SIRT1-LXR信號(hào)通路的影響.pdf

1、目的：
　　探討氧化性低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,oxLDL)和膽固醇(Cholesterol,CH)對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)脂肪積累以及對(duì)SIRT1-LXR和NF-κB-TNFα信號(hào)通路的影響,深入探討脂肪肝等代謝綜合癥形成的分子機(jī)制。
　　研究表明,脂肪肝發(fā)病過(guò)程中不僅涉及脂代謝紊亂、脂肪積累、同時(shí)還伴隨著炎癥反應(yīng),多種因素參與了該病的發(fā)病過(guò)程,它是一種復(fù)雜的代謝性疾病。SIRT1參

2、與多種信號(hào)通路調(diào)控,具有預(yù)防高脂飲食所造成的脂肪肝等代謝性疾病、延長(zhǎng)壽命的作用,該信號(hào)路的調(diào)控過(guò)程涉及細(xì)胞程序性死亡,細(xì)胞分化以及能量代謝等;肝細(xì)胞X受體(liver X-activated receptors,LXR)是核受體超家族成員,主要調(diào)控膽固醇吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝等過(guò)程,維持體內(nèi)甾醇和脂代謝和糖代謝平衡,同時(shí)參與炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)。ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋G1(ATP-binding cassette transporter G1,ABCG

3、1)是LXRα的靶分子,參與膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)、調(diào)節(jié)脂代謝,參與凋亡細(xì)胞清除和有毒物質(zhì)去除等。另外有報(bào)道,在脂肪肝等代謝綜合癥發(fā)生過(guò)程中,炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子(如NF-κB)及腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNFα)等多種炎癥因子明顯增高;而SIRT1過(guò)表達(dá)或被激活,NF-κB的乙?；潭缺銜?huì)受到抑制,從而會(huì)抑制炎癥反應(yīng)信號(hào)通路、減輕細(xì)胞損傷、改善糖代謝。
　　基于以上背景,我們推測(cè):在高脂或/和高ox

4、LDL、CH環(huán)境,肝細(xì)胞中正常脂代謝受到影響,SIRT1-LXR信號(hào)通路可能受到抑制而NF-κB-TNFα炎癥信號(hào)通路被激活,從而造成脂肪肝的形成。
　　方法：
　　實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為7組:高糖對(duì)照組、氧化性低密度脂蛋白(oxLDL)組、高脂(high-fat,HF)組、HF+oxLDL組、高膽固醇組(CH)、能量限制(calorie restriction,CR)+CH組、CR組。其中除CR+CH和CR組細(xì)胞培養(yǎng)于低糖DMEM培

5、養(yǎng)基中,其他各組細(xì)胞均培養(yǎng)于高糖DMEM培養(yǎng)基中。另外,HF組培養(yǎng)基中加入0.1mmol/l的軟脂酸鈉;oxLDL組培養(yǎng)基中加入80μg/ml的oxLDL;HF+oxLDL組培養(yǎng)基中加入80μg/ml的oxLDL和0.1mM的軟脂酸鈉;CH組培養(yǎng)基中添加0.75g/L膽固醇;CR+CH組培養(yǎng)基加入0.75g/L膽固醇。細(xì)胞培養(yǎng)24h后用四氮唑藍(lán)比色分析法(MTT)檢測(cè)細(xì)胞活力,確定CH有效作用濃度;培養(yǎng)48h后用油紅O染色法定性拍照觀察

6、和通過(guò)測(cè)定OD值定量檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)脂肪積累,并采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)方法檢測(cè)SIRT1、LXRα及其靶基因ABCG1和NF-κB,TNFαmRNA相對(duì)表達(dá)水平。
　　定量油紅O染色法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)脂肪積累用spss15.0進(jìn)行協(xié)方差分析(analysis of covariance);繪圖和mRNA定量分析用Graph Pad Prism 5,組間比較用one-way ANOVA(and nonparametric)方法

7、(Test name為Newman-Keuls,即SNK法)。P<0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　MTT檢測(cè)結(jié)果顯示,CH濃度從0g/L上升到0.125g/L,細(xì)胞活力顯著下降,CH濃度在0.125-1.0g/L時(shí),細(xì)胞活力基本保持穩(wěn)定,濃度高于1.0g/L細(xì)胞活力進(jìn)一步迅速下降。與對(duì)照組比,oxLDL組、CH組、HF組、HF+oxLDL組和HF+CH組細(xì)胞內(nèi)脂肪含量均增加(P<0.05),CR組細(xì)胞中脂肪含量

8、降低(P<0.05),HF+CH組要比HF組高(P<0.05);而oxLDL組和HF+oxLDL組脂肪含量比較接近,差異也不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,并且它們分別低于HF組(均P<0.05);CH組和HF+CH組脂肪含量較接近,差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。RT-PCR結(jié)果顯示,與對(duì)照組比,CH組和CH+CR組SIRT1、LXRα和ABCG1mRNA表達(dá)均增加(均P<0.05);oxLDL組SIRT1、LXRα和ABCG1三種分子mRNA表達(dá)均增加,其中

9、SIRT1和LXRα差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);HF+CH組三種分子mRNA表達(dá)均降低,其中SIRT1和LXRα差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);HF組SIRT1和LXRα與對(duì)照比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而ABCG1顯著低于對(duì)照(P<0.05);HF+oxLDL組LXRα和ABCG1表達(dá)均顯著降低(均P<0.05),而SIRT1與對(duì)照組比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。NF-κB,TNFα分子mRNA表達(dá)結(jié)果前后差異較大,結(jié)果不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。<

10、br>　　結(jié)論：
　　oxLDL、CH和HF均可使脂肪在肝細(xì)胞中堆積,其中CH使細(xì)胞中脂肪積累較多。在HF中加入oxLDL或CH,肝細(xì)胞中脂肪可能會(huì)進(jìn)一步增加。oxLDL、CH對(duì)三種mRNA影響具有相似性,它們都能夠使SIRT1、LXRα和ABCG1三種分子表達(dá)增加,而oxLDL+HF、CH+HF可以抑制這三種分子mRNA的表達(dá),并且oxLDL+HF、CH+HF對(duì)三種分子mRNA的抑制作用可能要大于單獨(dú)HF。因此,oxLDL或CH