補體激活在三氯乙烯致敏小鼠肝臟損害中作用研究.pdf

1、研究背景：
　　三氯乙烯(TCE)是工業(yè)上廣泛使用的一種有機溶劑,除了作為高分子化合物的原料以外,60％被五金、玩具、電子等行業(yè)用作金屬部件和電子元件清洗劑,主要應用在清洗線路板,金屬表面脫污去污,也常用作油脂、石蠟的萃取劑,還可用于印染油墨、斑點去污劑、打字改正液等。大量的臨床病例顯示DMLT患者除了全身性皮膚損害外,還伴有肝損傷,并且DMLT的致死主要原因是肝功能衰竭,因此肝臟損傷的機制研究在DMLT防治工作中顯的尤為重要。但

2、有相關研究還發(fā)現(xiàn),TCE所致的藥疹樣皮炎,特別是免疫性肝臟損傷,不能用遲發(fā)型IV型變態(tài)反應完全解釋。補體激活可能在TCE所致的免疫性肝損傷中也發(fā)揮一定的作用,提示在DMLT患者出現(xiàn)的肝功能損傷發(fā)生過程中除了IV型變態(tài)反應參與外,還可能有補體激活機制參與。
　　研究目的：
　　通過檢測TCE致敏小鼠不同組別和時點小鼠血清和肝臟中補體活化產(chǎn)物C3a、C5a和C5b-9的表達水平,結合肝功能檢查、肝臟臟器系數(shù)檢查,探討TCE致敏小

3、鼠補體激活其與肝損傷的關系,最終闡明TCE的危害及其機理并制定防治對策提供理論依據(jù)。
　　研究方法：
　　選用6～8周健康雌性BALB/c小鼠75只,隨機分成空白對照組、溶劑對照組、TCE處理組。建立BALB/c小鼠致敏模型,觀察記錄小鼠背部受試部位的皮膚致敏反應情況。根據(jù)末次激發(fā)24h后小鼠的致敏結果以及取材時點的不同(分別于末次激發(fā)后24h、48h、72h和7d采血,無菌取皮膚組織和肝臟組織),將TCE處理組分為致敏24

4、h、48h、72h和7d組和未致敏24h、48h、72h和7d組。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測各組血清中C3a-desArg、C5a-desArg和C5b-9水平。免疫組織化學法檢測肝臟組織中C3a、C5a和C5b-9的表達。直接免疫熒光法檢測肝臟組織中的C5b-9表達。RT-PCR法檢測肝臟組織中C3mRNA表達水平。
　　結果：
　　1.致敏率在皮膚致敏反應試驗中,空白對照組、溶劑對照組均未見紅斑或水腫,TCE處理組63只小鼠

5、中有23只背部皮膚出現(xiàn)不同程度的紅斑和水腫,其余40只為未致敏組,致敏率達36.5%,致小鼠致敏強度為中度
　　2.肝功能及臟器系數(shù)檢測結果
　　肝功能檢測結果,空白對照組各指標與溶劑對照組相比,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與溶劑對照組24h、48h、72h、7d致敏組相比,AST明顯增高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與相應的未致敏組相比,24h、48h、72h、7d致敏組AST明顯增高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0

6、.05)。ALT檢查結果發(fā)現(xiàn),空白對照組與溶劑對照組相比,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);72h致敏組與溶劑對照組相比ALT明顯增高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與相應的未致敏組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。7d致敏組與溶劑對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　空白對照組與溶劑對照組相比,小鼠肝臟臟器系數(shù)無明顯變化,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);然而,24h、48h、72h致敏組臟器系數(shù)顯著高于溶

7、劑對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);同時點組間比較,致敏組的臟器系數(shù)均高于相應未致敏組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);且在末次激發(fā)后72h達到最高,24h、48h、72h致敏組之間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　3.血清C3a-desArg、C5a-desArg和C5b-9水平
　　3.1.血清C3a-desArg水平:末次激發(fā)后,各組小鼠血清中C3a-desArg的水平,空白對照組與溶劑對照組相比,差

8、異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。24h、48h、72h、7d致敏組顯著高于溶劑對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);同時點相比較,致敏組的C3a-desArg水平均高于相對應未致敏組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);7d致敏組與溶劑對照組相比無明顯差異,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。且24h、48h、72h致敏組之間相比差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　3.2.血清C5a-desArg水平:末次激發(fā)后,各組小鼠血

9、清中C5a-desArg的水平,空白對照組與溶劑對照組相比,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。24h、48h、72h、7d致敏組顯著高于溶劑對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);同時點相比較,致敏組的C5a-desArg水平均高于未致敏組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);24h、48h、72h、7d致敏組之間的差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　3.3.血清C5b-9水平:末次激發(fā)后,各組小鼠血清中C5b-9的水平,空

10、白對照組與溶劑對照組相比,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。24h、48h、72h、7d致敏組顯著高于空白對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與溶劑對照組相比,72h致敏組明顯升高,同時點相比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);72h致敏組的C5b-9水平均高于未致敏組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);且24h、48h、72h、7d致敏組之間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　4.激發(fā)后肝臟組織中C3a、C5a和C

11、5b-9的表達
　　4.1.C3a表達水平:空白對照組與溶劑對照組相比,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。致敏24h、48h、72h組較溶劑對照組相比評分顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);其中致敏72h組表達最高,致敏24h、48h、72h組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);然而致敏7d組C3a表達顯著降低,與溶劑對照組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　4.2.C5a表達水平:空白對照組與溶劑對照組

12、相比,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。致敏24h、48h、72h、7d組較溶劑對照組顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);其中致敏72h組表達最高,致敏24h、48h、72h組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);然而致敏7d組C5a表達顯著降低,與致敏72h組比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　4.3.C5b-9表達水平:空白對照組與溶劑對照組相比,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。24h、48h、72h、7

13、d致敏組較溶劑對照組顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);其中致敏72h組表達最高,致敏24h、48h、72h組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。同時點之間相比較發(fā)現(xiàn),致敏24h、48h、72h組C5b-9表達水平分別高于未致敏24h、48h、72h組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。7d致敏組與其未致敏組相比無明顯變化,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　5.免疫熒光法檢測激發(fā)后肝臟組織中C5b-9的表達

14、　　我們對C5b-9在肝臟中的表達進行了更深一步的免疫熒光檢測,24h、48h、72h致敏組可以看到明顯的表達,并且在72h致敏組表達最高。
　　6.RT-PCR法檢測C3mRNA表達情況
　　應用RT-PCR技術檢測各組小鼠肝臟組織中C3mRNA表達情況,灰度值分析顯示24h、48h致敏組與空白對照組、溶劑對照組、各自未致敏組相比C3mRNA表達明顯增強(P<0.05),但是72h致敏組C3mRNA有明顯的降低,差異有統(tǒng)計

15、學意義(P<0.05),7d致敏組表達無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。
　　結論：
　　1.TCE在一定劑量下能對小鼠致敏,致敏率為36.5%,TCE對BALB/c小鼠皮膚具有中度致敏作用。
　　2.TCE暴露可造成小鼠肝功能損傷和臟器系數(shù)的改變,72h組之前損傷程度隨時間進行而加重。
　　3.TCE致敏小鼠體內(nèi)補體系統(tǒng)可能被激活,且補體激活及其產(chǎn)物在TCE接觸過敏性皮炎肝臟損傷發(fā)生過程中可能發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)作用