共代謝生物催化三氯乙烯降解工藝與機(jī)理研究.pdf

1、具有“致畸、致癌、致突變”效應(yīng)的揮發(fā)性氯代烴三氯乙烯（Trichloroethene，TCE），是一種重要的有機(jī)溶劑和化工原料，但使用過(guò)程中的不當(dāng)處置導(dǎo)致 TCE泄露和直接排放，嚴(yán)重污染了水體、土壤和大氣環(huán)境。作為重要的 TCE人為源，生活垃圾填埋場(chǎng)在有機(jī)物降解過(guò)程也產(chǎn)生了大量的氯代烴污染物。生活垃圾填埋場(chǎng)在長(zhǎng)期溫室氣體甲烷，二氧化碳和揮發(fā)性氯代烴的脅迫下產(chǎn)生了大量功能微生物，又因?yàn)槲廴驹锤患幕旌暇壕哂懈吣褪芎突I(yíng)養(yǎng)的生物特性，可通

2、過(guò)共代謝、直接氧化等多種途徑更有效的降解氯代烴污染物，被認(rèn)為是去除 TCE等氯代烴類(lèi)污染物的有效途徑。據(jù)此，本文以明晰填埋場(chǎng)中功能微生物種群結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)高效甲烷減排及 TCE生物降解為目標(biāo)，以垃圾填埋覆蓋土為生物介質(zhì)，開(kāi)展了功能微生物篩選、功能基因簇序列分析及氯代烴生物降解等系列研究，結(jié)論如下：
　　1）考察了典型垃圾填埋覆蓋土的甲烷氧化能力，發(fā)現(xiàn)重慶地區(qū)的甲烷氧化能力較強(qiáng)，初始體積濃度14％的甲烷經(jīng)150 h降解率達(dá)到99.8%。

3、土樣在pH值6.0至-8.8的范圍內(nèi)均具有較強(qiáng)的甲烷氧化能力，在pH=7.02甲烷降解能力最強(qiáng)，添加NMS培養(yǎng)基可提高土壤微生物的甲烷氧化效果。
　　2）分離了一株可降解TCE的甲烷氧化菌JTC3，該菌株對(duì)TCE有較強(qiáng)的降解能力，初始濃度為15.64μmol/L時(shí)，5 d降解率為93.79％。且低濃度的TCE（12.55-20.76μmol/L）對(duì)甲烷氧化有促進(jìn)作用。經(jīng)16S rDNA序列測(cè)序比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析鑒定為兼性甲烷氧化

4、菌Methylocystis sp。用半巢式PCR法分段擴(kuò)增菌株的顆粒性甲烷單加氧酶（pMMO）基因簇并進(jìn)行T-A克隆測(cè)序，經(jīng)擴(kuò)增、測(cè)序、拼接得到了3227 bp的pmoCAB基因簇序列，包括771 bp的pmoC基因、759 bp的pmoA基因、1260 bp的pmoB基因和2個(gè)非編碼中間序列，所對(duì)應(yīng)γ、β、α亞基理論分子量分別為29.1 kDa、28.6 kDa和45.6 kDa。
　　3）從填埋了2年的重慶市長(zhǎng)生橋填埋場(chǎng)富集

5、到以甲烷為碳源的混合菌群，命名為SWA1。SWA1能以甲烷為碳源，實(shí)現(xiàn)連續(xù)穩(wěn)定的離位培養(yǎng)，非甲烷類(lèi)水溶性碳源會(huì)促使不能利用甲烷的菌株成為優(yōu)勢(shì)菌種。低濃度（14.06μmol/L）TCE可以促進(jìn)混合菌群的生長(zhǎng)，輔酶因子銅離子濃度的升高促進(jìn)混合菌群的生長(zhǎng)及甲烷降解能力的提高。
　　4）對(duì)混合菌群 SWA1生物降解 TCE的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化。在14.06-110.23μmol/L TCE濃度范圍內(nèi)，TCE濃度越高降解速率越高，降解率在

6、TCE總初始濃度為110.23μmol/L時(shí)達(dá)到最大87.79%。TCE的生物降解依靠生物酶的催化作用，在共代謝基質(zhì)甲烷消耗完之后，微生物存在的加氧酶依然可以維持 TCE降解活性，但是隨著能量的不斷消耗，TCE降解會(huì)減弱。銅離子能夠促進(jìn)混合菌群生長(zhǎng)和TCE降解，TCE在低銅離子濃度區(qū)（0-0.75μmol/L）和高銅離子濃度區(qū)（1-15μmol/L）分別存在降解峰值，當(dāng)c(Cu2+)=0.03μmol/L時(shí)，TCE降解率達(dá)到最高95.7

7、5%，當(dāng)銅離子濃度為5μmol/L時(shí)，TCE降解率達(dá)到最高的84.75%。
　　5）通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time quantitative reverse transcription PCR，RT-qPCR）、T-A克隆測(cè)序和高通量測(cè)序技術(shù)分析混合菌群的群落結(jié)構(gòu)變化，推演了TCE生物降解機(jī)理。熒光定量PCR結(jié)果表明，顆粒型甲烷單加氧酶（particulate methane monooxygenase，pMMO

8、）是TCE降解過(guò)程中的關(guān)建酶，在銅離子濃度為0.03μmol/L時(shí)，pmoA基因和mmoX基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)豐度出現(xiàn)峰值，添加銅離子有利于LmpH基因的表達(dá)。同時(shí)低濃度TCE（＜32.17μmol/L）的添加對(duì)pmoA的表達(dá)影響不大。T-A克隆結(jié)果表明，TCE的加入改變微生物群落結(jié)構(gòu)，使甲烷氧化菌豐度減少，增加了非甲烷氧化菌的種類(lèi)，同時(shí)甲烷及 TCE的代謝產(chǎn)物為非甲烷氧化菌提供了原料，使得原來(lái)低豐度的微生物復(fù)蘇。高通量測(cè)序結(jié)果表明，混合菌群

9、 SWA1中優(yōu)勢(shì)微生物為甲基孢囊菌科 Methylocystaceae的甲烷氧化菌，此外還有乳球菌屬 Lactococcus和芽胞桿菌屬Bacillus等可降解TCE的微生物。銅離子濃度的增加刺激II型甲烷氧化菌的生長(zhǎng)，同時(shí)對(duì)其他非甲烷氧化菌的抑制作用使得高銅離子濃度范圍混合菌群的微生物多樣性降低，銅離子低濃度區(qū)間0-0.75μmol/L和高濃度區(qū)間1-15μmol/L，TCE降解機(jī)理不同，低濃度區(qū)間主要是 pMMO，溶解型甲烷單加氧酶