經(jīng)腦室少突膠質(zhì)祖細(xì)胞移植對腦室周圍白質(zhì)軟化大鼠髓鞘修復(fù)的研究.pdf

1、[目的] 通過熒光標(biāo)記的體外培養(yǎng)獲得少突膠質(zhì)細(xì)胞/II型星形膠質(zhì)祖細(xì)胞(oligodendrocyte/type II astrocyte，O2A祖細(xì)胞，也稱少突膠質(zhì)祖細(xì)胞)，經(jīng)側(cè)腦室移植到新生大鼠腦室周圍白質(zhì)軟化模型(periventricular lerkomalacia，PVL)上。通過Western blot技術(shù)、實(shí)驗(yàn)動物認(rèn)知評價對經(jīng)側(cè)腦室移植O2A祖細(xì)胞的PVL模型大鼠進(jìn)行評估。為干細(xì)胞移植治療少突膠質(zhì)細(xì)胞損傷后髓鞘形

2、成障礙或脫髓鞘疾病的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 [方法] 1.采用兩次恒溫?fù)u床振蕩分離純化法和條件限定培養(yǎng)基培養(yǎng)，獲取大鼠少突膠質(zhì)祖細(xì)胞。免疫熒光染色法鑒定細(xì)胞類型并判斷純度。 2.通過對3日齡新生SD大鼠進(jìn)行雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎的方法，建立腦室周圍白質(zhì)軟化新生大鼠動物模型。并用組織病理學(xué)，少突膠質(zhì)前體細(xì)胞凋亡檢測，實(shí)驗(yàn)動物生長發(fā)育及神經(jīng)行為學(xué)等方法對動物模型評價。 3.體外培養(yǎng)獲得O2A祖細(xì)，并在成功創(chuàng)建了新生大鼠

3、腦室周圍白質(zhì)軟化模型的基礎(chǔ)上，對建模后72h的PVL新生大鼠進(jìn)行經(jīng)側(cè)腦室O2A祖細(xì)胞移植治療。 通過Western blot技術(shù)、實(shí)驗(yàn)動物認(rèn)知評價對經(jīng)側(cè)腦室移植O2A祖細(xì)胞的PVL模型大鼠進(jìn)行評估。 [結(jié)果] 1.從新生SD大鼠皮層分離的O2A祖細(xì)胞胞體呈圓形，常有單極或雙極突起，形成克隆球，A285標(biāo)記陽性，免疫熒光鑒定細(xì)胞純度可達(dá)95％。體外培養(yǎng)時O2A細(xì)胞具有雙向分化的能力，在不同誘導(dǎo)條件下可分化為星型膠質(zhì)

4、細(xì)胞或少突膠質(zhì)細(xì)胞。 2.對3日齡新生SD大鼠進(jìn)行雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎后，模型組與對照組大鼠相比，模型組大鼠生長緩慢，睜眼時間延遲，懸崖逃避能力及雙臂懸吊能力均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。在水迷宮實(shí)驗(yàn)中，模型組大鼠在水中尋找站臺的游泳速度減慢、尋找站臺的所用的時間延長(即模型組的平均逃避潛伏期比對照組延長)、撤去平臺后在平臺所在象限停留時間縮短(即模型組第三象限停留時間比對照組縮短)。 3.腦組織HE染色，模型組術(shù)后24小時、4

5、8小時可見彌散性皮質(zhì)下和腦室周白質(zhì)疏松水腫。術(shù)后1周模型組腦白質(zhì)水腫明顯減輕，但腦白質(zhì)疏松，組織結(jié)構(gòu)層次與對照組相比不清晰。術(shù)后3周時模型組腦白質(zhì)膠質(zhì)細(xì)胞增生形成膠質(zhì)結(jié)節(jié)。術(shù)后4周時模型組腦白質(zhì)膠質(zhì)細(xì)胞消失，形成網(wǎng)格狀的軟化灶。 4.激光共聚焦掃描顯微鏡觀察，模型組術(shù)后側(cè)腦室周O4和TUNEL雙陽性。結(jié)果說明模型所致腦白質(zhì)損傷主要以O(shè)4陽性的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞為主。 5.O2A祖細(xì)胞移植后水迷宮實(shí)驗(yàn)顯示PVL+O2A祖細(xì)胞

6、移植組大鼠水中尋找平臺的游泳速度較快、尋找平臺的所用的時間比PVL+PBS組、PVL組縮短縮短，撤去平臺后在平臺所在象限停留時間比PVL+PBS組、PVL組延長。 6.Western blot半定量技術(shù)檢測PVL+O2A祖細(xì)胞移植組、PVL+PBS組PVL組三組鼠腦白質(zhì)MBP表達(dá)量，顯示PVL組和PVL+PBS組在移植后7、14、28天即P13、P20、P34大鼠腦白質(zhì)MBP表達(dá)量均低于同齡PVL+O2A祖細(xì)胞移植組。PVL組與

7、PVL+PBS組在移植后7、14、28天即P13、P20、P34大鼠腦白質(zhì)MBP表達(dá)量相比無差異。 [結(jié)論] 1.采用兩次恒溫?fù)u床振蕩分離純化法和條件限定培養(yǎng)基培養(yǎng)，可獲取高純度的大鼠少突膠質(zhì)祖細(xì)胞。 2.通過對3日齡新生SD大鼠進(jìn)行雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎的方法，可建立與人類早產(chǎn)兒腦室周圍白質(zhì)軟化病理相似的腦室周圍白質(zhì)軟化動物模型。 3.移植的O2A祖細(xì)胞可以促進(jìn)損傷髓鞘的修復(fù)。間接提示移植的O2A祖細(xì)胞可分化