大鼠膿毒癥“免疫麻痹”模型的構(gòu)建及炎癥特點(diǎn)的初步分析.pdf

1、第一部分“二次打擊”膿毒癥繼發(fā)肺炎大鼠模型的構(gòu)建及炎癥特點(diǎn)分析
　　研究背景：
　　膿毒癥是繼發(fā)于感染的系統(tǒng)炎癥反應(yīng)綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS），由于其高發(fā)病率和高死亡率，一直是研究的熱點(diǎn)。臨床和動(dòng)物研究結(jié)果均顯示，免疫反應(yīng)的變化對(duì)膿毒癥的預(yù)后起著重要的作用。既往觀點(diǎn)認(rèn)為，機(jī)體在細(xì)菌內(nèi)毒素攻擊后，可產(chǎn)生大量的炎癥細(xì)胞因子，引起全身炎癥反應(yīng)，并誘發(fā)多器官功能

2、衰竭。動(dòng)物研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，膿毒癥模型的動(dòng)物多由于炎癥早期“促炎因子風(fēng)暴”導(dǎo)致死亡;相較之下，臨床患者?？尚颐庥谠缙诟腥荆珔s因膿毒癥的持續(xù)存在或既發(fā)感染的出現(xiàn)，導(dǎo)致病情急劇加重、住院時(shí)間延長(zhǎng)，甚至死亡率明顯升高;這可能與膿毒癥病程中出現(xiàn)的代償性抗炎反應(yīng)(Compensatoryanti-inflammatory response syndrome，CARS)導(dǎo)致機(jī)體處于“免疫麻痹”（或稱免疫抑制）狀態(tài)相關(guān)。
　　研究目的：
　

3、　本研究的目的是通過構(gòu)建膿毒癥大鼠模型，觀察膿毒癥各發(fā)病階段炎癥反應(yīng)的改變，認(rèn)識(shí)“免疫麻痹”出現(xiàn)時(shí)機(jī)及免疫應(yīng)答能力。同時(shí)，模擬臨床膿毒癥繼發(fā)感染的發(fā)病情況，構(gòu)建“二次打擊”模型，即在膿毒癥“免疫麻痹”時(shí)期繼發(fā)肺部感染，探究二次打擊對(duì)機(jī)體的損害與免疫狀態(tài)的相關(guān)性。
　　研究方法：
　　36只約250g SD雄性大鼠采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(cecal ligation puncture，CLP)建立膿毒癥模型（其中CLP組30只，正

4、常對(duì)照組6只）。隨機(jī)選取膿毒癥大鼠12只分別在CLP術(shù)后第4天或第7天分別經(jīng)鼻腔注射肺炎鏈球菌200μ1（細(xì)菌濃度為1×1010 CFU/ml）導(dǎo)致繼發(fā)肺部感染，從而構(gòu)建“二次打擊”模型。觀察單純CLP組及“二次打擊”組大鼠術(shù)后生存狀態(tài)及死亡時(shí)間。分別留取單純CLP術(shù)后第1、4、7天及“二次打擊”組大鼠給菌后1天的血清及脾臟組織標(biāo)本。
　　分別檢測(cè)各種大鼠的血常規(guī)、外周血菌落計(jì)數(shù)及生化指標(biāo)。流式細(xì)胞術(shù)(FCM)計(jì)數(shù)脾臟樹突狀細(xì)胞、

5、CD4+、CD8+及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例;ELISA法檢測(cè)血清炎癥因子水平;HE染色及TUNEL檢測(cè)評(píng)估脾臟組織損害和細(xì)胞凋亡程度。
　　研究結(jié)果：
　　觀察各模型大鼠術(shù)后狀態(tài)，CLP術(shù)后大鼠出現(xiàn)呼吸急促、嗜睡、腹部膨隆等，且在術(shù)后12h內(nèi)即開始出現(xiàn)死亡?！岸未驌簟苯M大鼠在鼻腔給菌后6h內(nèi)即出現(xiàn)呼吸音粗、紫紺等肺部感染表現(xiàn)。單純膿毒癥組大鼠生存率為73.33％(11/15)術(shù)后第4天給菌組大鼠生存率為26.67％(4/15)，

6、較單純CLP組明顯升高(P＜0.05);而術(shù)后第7天給菌組較單純膿毒癥組死亡率無明顯差異(P=0.467)。
　　外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果示，膿毒癥大鼠在CLP術(shù)后d1白細(xì)胞數(shù)量達(dá)高峰(15.57±2.77×109/L)，且外周血中菌落計(jì)數(shù)量達(dá)高峰;而術(shù)后d4給菌組細(xì)菌清除力較同時(shí)期單純CLP組顯著下降(1.78 vs.0.25 log CFU/ml，P＜0.05)。同時(shí)，CLP術(shù)后d1，大鼠的肝腎功能指標(biāo)升高，但“二次打擊”組分別

7、與同時(shí)期膿毒癥組均無明顯差異。
　　各組大鼠脾臟流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DC比例在術(shù)后第1天達(dá)高峰(0.87±0.31％)，CLP術(shù)后d4組，DC、CD4+、CD8+T細(xì)胞比例顯著下降。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例的高峰出現(xiàn)在術(shù)后第4天(3.14±0.74％)，術(shù)后d7逐漸恢復(fù)正常?！岸未驌簟苯M與同時(shí)期單純膿毒癥組比較無明顯差異
　　血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平的高峰均出現(xiàn)在膿毒癥發(fā)生后24h，而HMGB-1的高峰出現(xiàn)在術(shù)后第4天（

8、1.76±0.71 ng/ml）?？寡滓蜃覫L-10、TGF-β1水平的高峰出現(xiàn)在膿毒癥中，后期下降;sTNFR-I在CLP術(shù)后d7仍維持于高濃度(1.56±0.39 pg/ml)。術(shù)后d4給菌組大鼠炎癥因子較同時(shí)期單純膿毒癥組無明顯差異，術(shù)后d7給菌組IL-1β及TGF-β1較同時(shí)期膿毒癥大鼠升高(P＜0.05)。
　　HE染色和TUNEL檢測(cè)結(jié)果示膿毒癥可導(dǎo)致大鼠脾臟組織結(jié)構(gòu)破壞顯著，凋亡顯著。CLP術(shù)后d4給菌組與同時(shí)期單純

9、膿毒癥組相比，凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增加（74.48個(gè)/HP vs.52.99個(gè)/HP，P＜0.05）;而術(shù)后d7給菌組較同時(shí)期膿毒癥組差異無明顯差異。
　　研究結(jié)論
　　采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)可成功構(gòu)建大鼠膿毒癥模型，且可出現(xiàn)膿毒癥各發(fā)病階段相應(yīng)的癥狀和體征，導(dǎo)致菌血癥的出現(xiàn)及肝腎功能的損害。膿毒癥發(fā)生后，免疫細(xì)胞的數(shù)量減少、抗炎因子水平升高及脾臟凋亡加重，提示大鼠出現(xiàn)“免疫麻痹”狀態(tài)。模擬臨床膿毒癥繼發(fā)肺炎的“二次打擊”模型，較單純

10、膿毒癥模型大鼠死亡率明顯升高，細(xì)菌清除力下降，可能與該時(shí)期機(jī)體存在的免疫麻痹相關(guān)。
　　第二部分合并慢性腎臟病大鼠膿毒癥模型的構(gòu)建及炎癥分析
　　研究背景：
　　針對(duì)膿毒癥的治療方法，從動(dòng)物模型轉(zhuǎn)化到臨床應(yīng)用經(jīng)常無法成功，這可能是由于大部分臨床膿毒癥患者常合并一種或多種基礎(chǔ)疾病，導(dǎo)致簡(jiǎn)單的動(dòng)物模型無法完全模擬人類膿毒癥的發(fā)病情況。既往研究發(fā)現(xiàn)，潛在的腎臟損傷可加重膿毒癥，導(dǎo)致死亡率升高及腎臟損害的進(jìn)一步加重，可能的機(jī)制

11、包括尿毒癥誘導(dǎo)的白細(xì)胞功能障礙、腎臟清除率下降所致的炎癥細(xì)胞因子聚集或其他合并癥等。因此，免疫功能的變化可能是合并慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)患者膿毒癥死亡率較普通人群顯著升高的重要原因之一。
　　研究目的：
　　本研究的目的是通過構(gòu)建合并慢性腎臟病(CKD)大鼠膿毒癥模型，觀察CKD大鼠膿毒癥各時(shí)期炎癥反應(yīng)的變化，并與單純膿毒癥模型相比較，了解并分析CKD大鼠在膿毒癥各病程階段免疫狀態(tài)

12、的變化及免疫抑制的程度。
　　研究方法：
　　24只約250g SD雄性大鼠采用5/6腎臟切除術(shù)（先行2/3左腎切，一周后行右腎全切）構(gòu)建慢性腎臟病(CKD)模型。對(duì)成功建模的CKD大鼠再行盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(CLP)構(gòu)建合并CKD大鼠膿毒癥模型。觀察實(shí)驗(yàn)術(shù)后生存狀態(tài)及死亡時(shí)間，并留取CKD大鼠CLP術(shù)后第0、1、4及7天的血清及脾臟組織標(biāo)本（各亞組大鼠數(shù)量n=6）。分別檢測(cè)各組大鼠的血常規(guī)、外周血菌落計(jì)數(shù)及生化指標(biāo)。流式細(xì)胞術(shù)

13、(FCM)計(jì)數(shù)脾臟樹突狀細(xì)胞(DC)、CD4+、CD8+T細(xì)胞及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例;ELISA法檢測(cè)血清炎癥因子水平;HE染色及TUNEL檢測(cè)評(píng)估脾臟組織損害和細(xì)胞凋亡程度。
　　研究結(jié)果：
　　CKD大鼠發(fā)生膿毒癥后的生存率較單純膿毒癥組下降(40％ vs.73.33％，P=0.094)。CKD大鼠基礎(chǔ)白細(xì)胞較正常大鼠高(10.21×109/L vs.4.04×109/L，P＜0.05)，且在CLP術(shù)后第1天達(dá)峰值(14.5

14、5±2.88×109/L)。合并CKD大鼠術(shù)后菌血癥較單純膿毒癥組加重(1.17±0.68 log CFU/ml，較單純CLP d4組0.25±0.28log CFU/ml，P＜0.05)。CKD大鼠發(fā)生膿毒癥后的肝腎功能指標(biāo)顯著升高，在膿毒癥后期，Scr、BUN水平持續(xù)升高，提示腎功能恢復(fù)的延遲。
　　CKD大鼠樹突狀細(xì)胞在CLP術(shù)后d4較基礎(chǔ)值顯著下降(0.75％ vs.1.23％，P＜0.05)，且在術(shù)后d7持續(xù)下降（0.4

15、4±0.08％，較CKD+CLP d4組P＜0.05）;重復(fù)測(cè)量分析法比較CKD+CLP與單純CLP組，結(jié)果示DC數(shù)量存在顯著差異(F=19.39，P＜0.05)。CD4+、CD8+T細(xì)胞在CKD+CLP d4組也顯著降低(較基礎(chǔ)值P＜0.05)，而Treg細(xì)胞膿毒癥發(fā)生后呈持續(xù)升高至CLP術(shù)后d7(與d4組比較，5.06％ vs.4.12％，P＜0.05)。與單純CLP模型比較，兩種模型不同時(shí)間點(diǎn)CD8+T和Treg細(xì)胞比例存在差別（

16、P＜0.05），而CD4+T細(xì)胞無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　CKD大鼠血清促炎及抗炎因子基礎(chǔ)水平均較正常大鼠明顯升高。膿毒癥發(fā)生后，促炎因子升高幅度低于單純膿毒癥組?？寡滓蜃釉谀摱景Y發(fā)生后也明顯升高，且sTNFR-Ⅰ的高峰持續(xù)至術(shù)后第7天（2.44 vs.1.50 pg/ml，P＜0.05）;與單純CLP組大鼠相比，抗炎因子水平在各發(fā)病階段均高于單純膿毒癥組（P＜0.05）。主成分分析結(jié)果示在膿毒癥中期，抗炎因子逐漸占據(jù)優(yōu)勢(shì)，提示機(jī)體處于

17、“免疫麻痹”狀態(tài)，且合并CKD可加重免疫功能的損害，導(dǎo)致免疫抑制的加重及恢復(fù)的延遲。
　　TUNEL檢測(cè)結(jié)果示，CKD+CLP大鼠細(xì)胞凋亡較單純CLP組明顯加重(術(shù)后d4兩組模型比較，67.40 vs.52.99個(gè)/HP，P＜0.05)，也提示了CKD大鼠在膿毒癥發(fā)生中后期存在免疫抑制的加重。
　　研究結(jié)論：
　　該研究成功構(gòu)建了合并慢性腎臟病大鼠膿毒癥模型，復(fù)制了CKD患者膿毒癥高死亡率的臨床特征，較單純膿毒癥動(dòng)物模