過量碘致小鼠甲狀腺膠質(zhì)潴留機(jī)理研究及干預(yù)性功能食品研制.pdf

1、背景與目的:
　　甲狀腺膠質(zhì)潴留是指甲狀腺濾泡中膠質(zhì)（I-，T3、T4）合成過多，轉(zhuǎn)運(yùn)受阻的一種病態(tài)現(xiàn)象，是高碘性甲狀腺腫常見的病理特征。甲狀腺膠質(zhì)潴留的發(fā)生機(jī)理與諸多原因有關(guān)，其中碘攝入水平被認(rèn)為是最重要的影響因素。至今為止碘過量引起的作為甲狀腺腫大病理特征的甲狀腺膠質(zhì)潴留的發(fā)生機(jī)制尚不清楚，隨著其發(fā)病率逐年升高，近年來引起了高度重視。
　　甲狀腺膠質(zhì)潴留是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及多個(gè)環(huán)節(jié)，如碘攝入與轉(zhuǎn)運(yùn)、碘離子活化、酪氨酸殘

2、基的碘化和縮合作用、甲狀腺膠質(zhì)合成與儲(chǔ)存、甲狀腺膠質(zhì)的釋放、甲狀腺球蛋白水解以及甲狀腺激素轉(zhuǎn)運(yùn)等過程。以上過程緊密有序聯(lián)系，共同調(diào)節(jié)甲狀腺膠質(zhì)合成、釋放及轉(zhuǎn)運(yùn)，只要其中任何一個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)生異常都可能導(dǎo)致甲狀腺膠質(zhì)潴留發(fā)生。并且，若機(jī)體下丘腦—垂體—甲狀腺軸甲狀腺激素反饋?zhàn)饔檬д{(diào)也可加重甲狀腺膠質(zhì)潴留。然而，究竟是哪些關(guān)鍵環(huán)節(jié)及關(guān)鍵基因發(fā)生異常導(dǎo)致甲狀腺膠質(zhì)潴留的發(fā)生，以及下丘腦—垂體—甲狀腺軸在甲狀腺膠質(zhì)潴留的發(fā)生過程中如何發(fā)揮其調(diào)節(jié)機(jī)制，

3、目前都尚缺乏研究。甲狀腺膠質(zhì)潴留是高碘性甲狀腺腫常見的病理特征，全面認(rèn)識甲狀腺膠質(zhì)潴留的發(fā)生過程及機(jī)制將有利于揭示高碘性甲狀腺腫的發(fā)生機(jī)理。
　　因此，本課題建立7個(gè)月小鼠過量碘模型，研究甲狀腺膠質(zhì)合成、釋放與轉(zhuǎn)運(yùn)涉及的多個(gè)環(huán)節(jié)及相關(guān)調(diào)控基因，結(jié)合甲狀腺激素反饋機(jī)制，通過形態(tài)學(xué)方法和分子生物學(xué)方法從源頭開始探討長期過量碘致甲狀腺腫大病理特征甲狀腺膠質(zhì)潴留的發(fā)生機(jī)制，為進(jìn)一步闡明高碘性甲狀腺腫大機(jī)理提供有價(jià)值的資料。
　　同時(shí)

4、，本課題除了研究過量碘致小鼠甲狀腺膠質(zhì)潴留的機(jī)理，還進(jìn)行了相關(guān)干預(yù)性功能食品的研制。已有研究表明，過量碘能降低甲狀腺及血液抗氧化水平，引起氧化應(yīng)激，造成甲狀腺功能損傷，是甲狀腺膠質(zhì)潴留發(fā)生的可能機(jī)制，通過補(bǔ)充硒、維生素C、維生素E等抗氧化物質(zhì)可改善機(jī)體抗氧化水平。因此，研制富含抗氧化因子的功能食品，從食品治療角度預(yù)防甲狀腺疾病，特別是對高碘性甲狀腺腫大將起到積極的防治作用。本研究選擇了抗氧化能力較高的馬尾松松針提取液為原料，進(jìn)行馬尾松松

5、針提取液干預(yù)效果評價(jià)及馬尾松松針抗氧化酸奶加工工藝研究，為功能性酸奶的研發(fā)提供理論依據(jù)，從預(yù)防疾病的角度對過量碘造成的危害起到一定的積極防治作用。
　　方法:
　　1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)及分組
　　1)第一批：剛斷乳的SPF級BALB/C雌性小鼠300只，體重15-17g，3-4周齡，健康狀況良好，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。環(huán)境溫度22±2℃，濕度40％-70%，照明時(shí)間12±3h。定期清潔動(dòng)物房以及動(dòng)物用籠具、飲水瓶。適

6、應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按體重將動(dòng)物隨機(jī)分成5組，每組60只，每組分別給予自來水及含不同劑量KIO3高碘水，連續(xù)喂養(yǎng)7個(gè)月。劑量及分組如下：A組（正常對照組）：自來水；B組（高碘1組）：1500μg/L；C組（高碘2組）：3000μg/L；D組（高碘3組）：6000μg/L；E組（高碘4組）：12000μg/L。飲水以KIO3配制成碘濃度為600mg/L的碘標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液備用，各濃度的高碘水每周配制，小鼠自由飲水、飲食。飼料為廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中

7、心提供，飼料中的碘為365μg/kg。自來水中碘含量為8μg/L。
　　2)第二批：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇，飼養(yǎng)環(huán)境同前。BALB/C雌性小鼠28，隨機(jī)分成4組，分別為空白組，高碘組，對照組，干預(yù)組，每組8只。采用自由飲水方式，空白組給予自來水，高碘組給予3000μg/L碘水，對照組經(jīng)口灌胃0.02ml/g馬尾松松針提取液后自由飲用自來水，干預(yù)組經(jīng)口灌胃0.2ml/g馬尾松松針提取液后自由飲用3000μg/L高碘水。連續(xù)喂養(yǎng)3個(gè)月后，進(jìn)行

8、血清GSH-Px水平檢測，評估馬尾松松針提取液干預(yù)效果。
　　2.小鼠甲狀腺膠質(zhì)潴留產(chǎn)生的檢測
　　7個(gè)月后測定甲狀腺臟器指數(shù)，病理切片下觀察甲狀腺組織變化，免疫組化分析甲狀腺球蛋白表達(dá)情況，利用放免試劑盒檢測血液TSH、FT4、FT3水平。
　　3.過量碘致小鼠甲狀腺膠質(zhì)潴留作用機(jī)制的研究
　　1)尿碘測定：7個(gè)月后收集小鼠晨尿，利用尿碘試劑盒測定小鼠尿碘水平。
　　2)甲狀腺攝碘率測定：在當(dāng)天上午，給全

9、部小鼠灌胃0.5 Mci I125，分別在灌胃后20min、2h時(shí)間點(diǎn)處死，摘取小鼠甲狀腺組織，稱重，用γ計(jì)算器分別測量20min、2h小鼠甲狀腺的放射性計(jì)數(shù)，本底計(jì)數(shù)，標(biāo)準(zhǔn)源計(jì)數(shù)，計(jì)算小鼠甲狀腺I125攝碘率。
　　3)甲狀腺基因測定：摘取小鼠甲狀腺組織及肝臟組織，用液氮迅速冷凍，-80℃保存?zhèn)溆?。qPCR法檢測甲狀腺組織中Tshr、Slc5a5（NIS)、Slc26a4（pendrin)、 Tpo、Duox2、Iyd、Ctsb

10、、Ctsd、Slc16a2（Mct8)的mRNA表達(dá)。
　　4)血清GPH-Px測定：7個(gè)月后收集小鼠血清，利用 GPH-Px試劑盒測定小鼠血清GPH-Px水平。
　　4.馬尾松松針提取液干預(yù)效果評估及其干預(yù)性功能食品加工工藝研究
　　通過檢測3個(gè)月小鼠血清GSH-Px水平，評價(jià)馬尾松松針提取液對過量碘危害的干預(yù)效果；通過單因素實(shí)驗(yàn)，正交實(shí)驗(yàn)法，感官評定，確定干預(yù)性功能食品馬尾松松針抗氧化酸奶的最佳工藝和配方。

11、　　結(jié)果:
　　1.過量碘致小鼠甲狀腺膠質(zhì)潴留的產(chǎn)生
　　1)過量碘對小鼠甲狀腺臟器/體重指數(shù)的影響
　　從碘濃度為3000μg/L的C組開始，過量碘可致甲狀腺臟器/體重指數(shù)明顯升高，與正常組對比有顯著性差異（P<0.05），經(jīng)Spearman相關(guān)檢驗(yàn)，小鼠甲狀腺臟器/體重指數(shù)與碘濃度呈顯著正相關(guān)（r=0.655，P=0.01）。
　　2)甲狀腺組織形態(tài)學(xué)觀察
　　光境下，可見正常對照組A組的甲狀腺濾泡中等

12、大小，呈圓形或橢圓形，濾泡上皮細(xì)胞多為單層立方狀或高柱狀。各高碘組的甲狀腺濾泡明顯增大，濾泡腔內(nèi)充滿紅色膠質(zhì)，上皮細(xì)胞呈扁平狀。高劑量組濾泡有融合現(xiàn)象。隨著碘濃度的升高，甲狀腺膠質(zhì)潴留現(xiàn)象越來越明顯。
　　3)免疫組化檢測甲狀腺組織中Tg蛋白的表達(dá)情況
　　免疫組化分析顯示正常對照組A組Tg有基礎(chǔ)表達(dá)，D、E組Tg在甲狀腺濾泡腔中表達(dá)的范圍和強(qiáng)度較對照組明顯增強(qiáng)。
　　4)過量碘對小鼠血清甲狀腺激素水平的影響
　

13、　從碘濃度為3000μg/L的C組開始，血清TSH水平升高與對照組相比有顯著性差異（P<0.05）；與正常組對比，所有實(shí)驗(yàn)組血清FT4水平升高與FT3水平降低有顯著性差異（P<0.05）；經(jīng)Spearman相關(guān)檢驗(yàn)，碘濃度與小鼠血清TSH呈顯著正相關(guān)（r=0.439，P=0.001），與血清FT4呈顯著正相關(guān)（r=0.649，P=0.000），與血清FT3呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.320，P=0.03）。
　　2.過量碘致小鼠甲狀腺

14、膠質(zhì)潴留作用機(jī)制的研究
　　1)過量碘對小鼠尿碘水平的影響
　　從碘濃度為1500μg/L的B組開始，小鼠尿碘水平與正常組相比明顯升高，差異有顯著性意義（P<0.05）。經(jīng) Spearman相關(guān)檢驗(yàn)，小鼠尿碘水平與碘濃度呈顯著正相關(guān)（r=0.878，P=0.000）。
　　2)過量碘對小鼠甲狀腺攝碘率的影響
　　灌胃20min后，與正常對照組相比，從碘濃度為3000μg/L的C組開始小鼠甲狀腺攝碘率明顯降低，差異

15、有顯著性意義（P<0.05）。灌胃2h后，與正常對照組A組相比，從碘濃度為1500μg/L的B組開始小鼠甲狀腺攝碘率明顯降低，差異有顯著性意義（P<0.001)。
　　3)過量碘對甲狀腺Tshr、Slc5a5（NIS)、Slc26a4（pendrin)、Tpo、Duox2、Iyd、Ctsb、Ctsd、Slc16a2（Mct8) mRNA表達(dá)水平的影響
　　過量碘明顯抑制了Tshr、NIS、Pendrin，Tpo、Duox2

16、mRNA的表達(dá)，下調(diào)嚴(yán)重程度依次為 NIS、Pendrin、TPO、Tshr、Duox2，表達(dá)有顯著差異（P<0.05）；而Iyd、Cstb、Cstd mRNA表達(dá)雖然有下降，但表達(dá)無顯著差異（P＞0.05），對于Mct8基因，只有碘濃度為6000μg/L的D組Mct8 mRNA表達(dá)下調(diào)，表達(dá)有顯著差異（P<0.05）。
　　4)甲狀腺細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損及溶酶體數(shù)量減少
　　電鏡結(jié)果顯示，正常對照組甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞

17、核呈圓形或橢圓形，各種細(xì)胞器均勻分布于細(xì)胞質(zhì)中，含有豐富的溶酶體。E組濾泡腔內(nèi)充滿電子密度高的物質(zhì)，可見膠質(zhì)滴，甲狀腺甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞扁平，核為長橢圓形，各種細(xì)胞器模糊不清，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)極度擴(kuò)張，脫顆粒，有的融合成不規(guī)則的囊泡，線粒體數(shù)目減少，空泡化，結(jié)構(gòu)模糊，溶酶體罕見。與正常對照組對比，高劑量碘組能使甲狀腺甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)受損和溶酶體數(shù)量明顯減少。
　　5)過量碘對小鼠血清GSH-Px活性的影響
　　與正常對照組A組

18、相比，從碘濃度為3000μg/L的C組開始小鼠血清GSH-Px活性水平明顯降低，有顯著性差異（P<0.05）。
　　3.馬尾松松針提取液干預(yù)效果評估及其干預(yù)性功能食品加工工藝研究
　　1)與高碘組相比，空白組、對照組、干預(yù)組小鼠血清GSH-Px活性水平明顯升高，有顯著性差異（P<0.05）。
　　2)馬尾松松針提取液最佳浸提工藝：料液比1:20（g/mL），浸提時(shí)間120 min，浸提溫度90℃；馬尾松松針提取液最佳酶

19、解澄清工藝：水浴溫度65℃，澄清時(shí)間2h，果膠酶濃度0.12%；馬尾松松針抗氧化酸奶的最佳配方：以松針提取液為溶劑，脫脂奶粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)14%，蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)7%，穩(wěn)定劑明膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%；馬尾松松針抗氧化酸奶最佳發(fā)酵工藝：復(fù)合發(fā)酵劑添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.12%，發(fā)酵時(shí)間為8h，發(fā)酵溫度為43℃；馬尾松松針抗氧化酸奶總抗氧化能力為51.31（U/mL），具有較強(qiáng)抗氧化能力。
　　結(jié)論:
　　1.過量碘致甲狀腺膠質(zhì)潴留是由甲狀腺膠質(zhì)合成