兔蒸發(fā)過強型干眼IL-6、TNF-α、ICAM-1的表達及其治療的實驗研究.pdf

1、目的： 干眼是指由于淚液的量或質(zhì)的異常引起的淚膜不穩(wěn)定和眼表面損害，從而導致眼不適癥狀的一類疾病，其臨床表現(xiàn)主要是眼疲勞，異物感，干澀感，燒灼感，畏光流淚眼紅等癥狀。隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展和人們生活水平的提高，干眼的發(fā)病率有明顯增高趨勢。 美國國立眼科研究所干眼研究組將干眼分為淚液生成不足型和蒸發(fā)過強型兩種。前者臨床上以干燥性角結(jié)膜炎(KCS)和Sjogren綜合征(SS)最為多見。后者則包括瞼板腺功能障礙(MGD)、暴露及

2、角膜接觸鏡等因素所致的干眼癥。 近年來免疫學和分子生物學的研究進展使我們對干眼的病因有了更新的認識，細胞因子作為一類由免疫細胞產(chǎn)生的高活性蛋白質(zhì)多肽分子，參與了免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，在干眼的發(fā)病機制中起到了十分重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，眼表面的免疫反應(yīng)和炎癥是影響干眼病情的一個非常重要的因素，SS和KCS患者的結(jié)膜、淚腺活檢標本內(nèi)和淚液中均發(fā)現(xiàn)炎癥細胞浸潤及炎癥反應(yīng)標記物表達，尤其是發(fā)現(xiàn)白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子(TIF-a

3、)、細胞間粘附因子(ICAM-1)等含量和表達增加，并和干眼的損害程度成正相關(guān)。然而蒸發(fā)過強型干眼發(fā)病機制是否也有細胞因子參與還未得到證實。 γ-亞麻酸是一種必需脂肪酸，具有廣泛的生理活性和明顯的藥理作用。國外有實驗表明其對KCS有一定療效，但具體作用機制不詳。動物模型是進行臨床和基礎(chǔ)研究的載體。本實驗采取對蒸發(fā)過強型干眼模型兔和正常兔眼角膜、結(jié)膜和淚液中炎癥標記物細胞因子IL-6、TNF-a的測定，以及粘附分子ICAM-1在角

4、膜結(jié)膜組織當中的表達，觀察這三種因子在蒸發(fā)過強型干眼中表達和變化，從而明確炎性因子在蒸發(fā)過強型干眼發(fā)病機制中的作用。同時治療組干眼兔給予口服γ-亞麻酸，觀察治療前后三種因子在上述組織中的變化及組織的病理改變，探討γ-亞麻酸在治療蒸發(fā)過強型干眼時的效果和機制，從而為臨床使用及推廣此藥提供理論依據(jù)。 方法: 1 選用健康新西蘭大白兔30只，雌雄不分，體重2-2.5kg，將實驗動物隨機分為3組，第1組10只兔，為正常組；第2組

5、10只兔，為對照組；第3組10只兔，為藥物治療組。 2 干眼模型制作：對照組和治療組兔采取手術(shù)顯微鏡下燒灼器逐個燒灼瞼板腺開口的方法封閉瞼板腺口，術(shù)后每天觀察兔角膜熒光素染色、Schirmer試驗和淚膜破裂時間(break uptime BUT)的變化，術(shù)后6周，根據(jù)診斷標準確診為成功制成干眼模型。 3 成功制成干眼模型后，治療組給予γ-亞麻酸膠囊灌胃治療，50mg，2次/天，共5周。模型組及正常組未予任何處理。用藥后每

6、日觀察三組兔角膜熒光素染色、Schirmer試驗和淚膜破裂時間的變化。 4 收集兔淚液：在盡量減少人為刺激的條件下，分別取正常組、對照組和治療組1、3、6、9、11周兔的淚液，分別用放免法及酶免法檢測淚液中IL-6、TNF-a的含量。 5 術(shù)后11周處死三組兔，取兔角膜及結(jié)膜組織行病理切片檢查，采用放免法及酶免法檢測三組兔角膜、結(jié)膜組織勻漿后IL-6、TNF-a的含量，同時應(yīng)用免疫組化方法檢測ICAM-1在三組兔角膜結(jié)膜組織的表

7、達情況。 6 本實驗數(shù)據(jù)平均值用x±s表示，采用單因素方差分析方法和兩樣本t檢驗，SPSS12.0軟件包進行統(tǒng)計學分析，得出其臨床意義。 結(jié)果: 1 根據(jù)制作蒸發(fā)過強型兔干眼模型前后測量Schirmer Ⅰ試驗、BUT、熒光素染色的變化(p<0.01)及干眼診斷標準，統(tǒng)計學結(jié)果顯示到第6周時，干眼模型達到診斷標準。用藥5周后觀察各項指標顯示治療組兔Schirmer Ⅰ試驗濾紙濕長較對照組增加，淚膜破裂時間延長，熒

8、光素染色評分下降，經(jīng)統(tǒng)計學處理有顯著性差異(p<0.01)。 2 術(shù)后6周三組兔淚液中IL-6、TNF-a含量對比，對照組與正常組相比較明顯增高(t=43.656；t=52.117)，治療組與正常組相比較明顯增高(t=52.503,t=51.692)，經(jīng)統(tǒng)計學處理有顯著性差異(p<0.001)。對照組與治療組比較，經(jīng)統(tǒng)計學處理無顯著性差異(t=0.628,p>0.05)。 3 術(shù)后11周組織病理學觀察：對照組角膜上皮細胞

9、層次增加，表面扁平細胞不規(guī)則缺失，基質(zhì)層水腫增厚，細胞成分增多，可見炎性細胞浸潤。結(jié)膜上皮細胞排列不規(guī)則，層次增加，杯狀細胞減少，基底層細胞見核分裂相，可見炎性細胞浸潤，治療組角膜上皮較完整，基質(zhì)層厚度接近正常組，結(jié)膜杯狀細胞數(shù)量較對照組明顯增加，但仍較正常組少，細胞排列較規(guī)則，炎性細胞浸潤減少。 4 術(shù)后11周三組兔IL-6、TNF-a含量對比，淚液中對照組含量高于正常組(t=19.815；t=19.313)，治療組中的含量明顯低于對

10、照組(t=16.794；t=16.834)，經(jīng)統(tǒng)計學處理，有顯著性差異(p<0.001)，治療組含量高于正常組，但經(jīng)統(tǒng)計學處理無顯著性差異(t=2.263；t=0.334，p>0.05)。角膜組織勻漿液中，對照組含量高于正常組(t=27.051；t=21.613)，治療組中的含量明顯低于對照組(t=24.730；t=19.788)，經(jīng)統(tǒng)計學處理，有顯著性差異(p<0.001)，治療組含量高于正常組，但經(jīng)統(tǒng)計學處理無顯著性差異(t=1.3

11、68；t=3.499，p>0.05)。結(jié)膜組織勻漿液中，對照組含量高于正常組(t=36.087；t=22.456)，治療組中的含量明顯低于對照組(t=42.925；t=28.574)，經(jīng)統(tǒng)計學處理，有顯著性差異(p<0.001)，治療組含量高于正常組，但經(jīng)統(tǒng)計學處理無顯著性差異(t=2.845；t=0.474，p>0.05)。 5 ICAM-1在三組兔角膜結(jié)膜組織上皮均有表達，陽性反應(yīng)物呈棕黃色，主要表達于細胞漿。每1000個細

12、胞陽性表達數(shù)角膜正常組為52.24±5.88，對照組為272.12±46.76，治療組為60.34±10.21；結(jié)膜正常組為60.36±15.34，對照組為302.67±56.28，治療組為74.32±21.45，對照組與正常組比較ICAM-1的表達明顯增加(t=26.384；t=30.572，p<0.001)，治療組與對照組相比較角膜結(jié)膜上皮ICAM-1的表達的明顯下降(t=25.021；t=29.894，p<0.001)，經(jīng)統(tǒng)計學處

13、理有顯著性差異。 結(jié)論: 1 蒸發(fā)過強型兔干眼模型角膜、結(jié)膜組織勻漿液及淚液中細胞因子IL-6、TNF-a含量比正常兔增高，細胞因子在蒸發(fā)過強型干眼的發(fā)病機制中起到重要的作用，蒸發(fā)過強型干眼的發(fā)病機制與炎癥有關(guān)。 2 粘附分子ICAM-1在蒸發(fā)過強型兔干眼模型角膜、結(jié)膜上皮表達與正常兔相比明顯增強，蒸發(fā)過強型干眼的發(fā)病機制有粘附分子的參與，與T淋巴細胞滲透有關(guān)。 3 γ-亞麻酸通過降低眼表細胞因子表達、抑制T淋巴