差速離心法分離培養(yǎng)人內(nèi)膜腺上皮細胞及OPN-MMP9在細胞中的表達和意義.pdf

1、本文主要從以下幾部分展開論述：
　　第一部分 室溫酶解結(jié)合差速離心法分離培養(yǎng)子宮內(nèi)膜上皮細胞及評估
　　目的：
　　探索室溫酶解消化結(jié)合改良式差速離心法在分離培養(yǎng)子宮內(nèi)膜腺上皮細胞的可行性，為進一步探索子宮內(nèi)膜藥物干預時機的選擇提供依據(jù)。
　　方法:
　　1.收集子宮腺肌癥患者的子宮內(nèi)膜標本,所得內(nèi)膜分為兩份，一份采用室溫酶解結(jié)合改良式差速離心法（改良組）分離，一份采用37℃水浴消化結(jié)合篩網(wǎng)法（對照組）分離

2、，并用光鏡、免疫細胞化學圖像分析進行細胞鑒定、純度分析,分別比較兩種方法分離培養(yǎng)子宮內(nèi)膜腺上皮細胞的數(shù)目、純度。
　　2.應用光鏡觀察細胞形態(tài)學變化，應用四甲基偶氮哩法(MTT)測定細胞不同時間點的OD值，繪制生長曲線。
　　結(jié)果:
　　1．改良組每1g內(nèi)膜組織可得到(9±1.7)×107/mL個腺上皮細胞，免疫細胞化學角蛋白表達陽性，純度達（97.8±0.002％；對照組可得到(3.9±0.78)×107個腺上皮細胞

3、，角蛋白表達陽性，純度達（88.6±0.006%,改良組分離的腺上皮細胞數(shù)量和純度均明顯高于對照組（P＜0.05）。培養(yǎng)無一例發(fā)生污染。
　　2．光鏡下觀察,兩組EEC外觀特征相似,細胞形態(tài)無差異，兩組細胞生長周期有顯著性差異，改良組細胞于15天開始衰退，而對照組細胞于8-10天開始衰退。
　　3．MTT結(jié)果顯示兩組細胞在不同時間點的OD450值在3～7d隨時間增加而升高。接種培養(yǎng)的兩組細胞均于第3天貼壁完全,且兩組之間OD

4、3值差異無顯著性；兩組細胞于第6天開始，改良組OD450明顯高于對照組OD450(P<0.01),即改良組分離得到的腺上皮細胞的生長速度及活性明顯高于對照組（P＜0.01），差異有顯著性差異。
　　結(jié)論:
　　1．單酶消化結(jié)合改良差速離心法能獲得高純度、數(shù)量多的子宮內(nèi)膜腺上皮細胞。
　　2．初步了解了原代培養(yǎng)的EEC的最佳生長時間為6-8天,為藥物干預時間的選擇提供了可靠地依據(jù)。
　　第二部分 OPN/MMP9在

5、分離培養(yǎng)的子宮腺上皮細胞中的表達及意義
　　目的：
　　檢測骨橋蛋白/MMP9在分離培養(yǎng)的子宮腺上皮細胞中的表達的特點，探討骨橋蛋白/MMP-9在子宮內(nèi)膜腺上皮細胞中的表達意義。
　　方法：
　　1.選擇10例子宮腺肌癥患者作為實驗組，6例子宮肌瘤患者作為對照組，通過對子宮內(nèi)膜腺上皮細胞的體外培養(yǎng)，采用實時定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(Real-time RT-PCR)分析OPN/MMP-9mRNA在實驗組、對照組子

6、宮內(nèi)膜腺上皮細胞的表達。
　　2.收集分離培養(yǎng)的不同時間的子宮腺肌癥患者內(nèi)膜上皮細胞，采用實時定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(Real-time RT-PCR)檢測OPN/MMP-9mRNA的表達。
　　結(jié)果：
　　1.OPNmRNA在培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜腺上皮細胞的表達：實驗組腺上皮細胞OPNmRNA的表達均較對照組升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而同一組中增殖期腺上皮細胞OPNmRNA的表達與分泌期相比，與月經(jīng)周期無關

7、，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）
　　2.MMP-9mRNA在培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜腺上皮細胞的表達：實驗組腺上皮細胞OPNmRNA的表達均較對照組升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而同一組中增殖期腺上皮細胞MMP-9mRNA的表達與分泌期相比，分泌期顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　3.OPN/MMP-9mRNA在分離的子宮腺肌癥內(nèi)膜腺上皮細胞培養(yǎng)的不同時間的表達：腺上皮細胞在分離培養(yǎng)的第7、8、9天，OP

8、N/MMMP-9mRNA表達無明顯差異；腺上皮細胞在分離培養(yǎng)的第7天，與分離培養(yǎng)的第3、12天相比，第7天OPN/MMMP-9mRNA表達顯著升高(P<0.01)。
　　結(jié)論：
　　1．OPNmRNA在子宮腺肌病內(nèi)膜上皮細胞中高表達，但與所分離的內(nèi)膜不同月經(jīng)周期無關，無明顯月經(jīng)周期，MMP-9在子宮腺肌病在位內(nèi)膜上皮細胞中分泌期高表達，可能與子宮腺肌病的侵襲過程有關，兩者在腺肌病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。
　　2．OP