家蠅幼蟲(chóng)血淋巴抗真菌肽MAF-1抗真菌機(jī)制初探.pdf

1、目的:制備家蠅幼蟲(chóng)血淋巴中的抗真菌肽，對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)與功能分析及抗真菌機(jī)制研究。
　　方法:1、家蠅幼蟲(chóng)血淋巴抗真菌肽的制備:采用剪頭法提取家蠅幼蟲(chóng)血淋巴;固相萃取、高效液相色譜分析、純化家蠅幼蟲(chóng)血淋巴;采用微量液體-菌落記數(shù)法檢測(cè)經(jīng)RP-HPLC分離純化得到的抗真菌肽抗白假絲酵母菌活性;對(duì)經(jīng)RP-HPLC純化后的抗真菌肽進(jìn)行SDS-PAGE分析，并初步測(cè)定抗真菌肽的分子量。2、結(jié)構(gòu)與功能分析:制備的抗真菌肽MAF-1在100℃30

2、min、1h和2％、5％SDS條件下通過(guò)圓二色譜和活性檢測(cè)探索其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。3、機(jī)制研究:利用掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，紫外分光光度計(jì)觀測(cè)細(xì)胞通透性變化及單細(xì)胞凝膠電泳(SCGE)觀察細(xì)胞內(nèi)DNA損傷情況。
　　結(jié)果:1、50％乙腈萃取洗脫組分經(jīng)RP-HPLC分析，在31.85min處均出現(xiàn)一響應(yīng)值較高、分離度較好的蛋白峰;從SDS-PAGE圖譜上觀察此峰在SDS-PAGE圖譜上僅顯示一個(gè)條帶，達(dá)到了電泳純，且測(cè)得其分子量為

3、17.136kDa;此峰在220nm處有最高吸收，在280nm處也有一定吸收，符合蛋白肽類(lèi)物質(zhì)的吸收光譜;微量液體-菌落記數(shù)法檢測(cè)結(jié)果顯示:此洗脫蜂具有抗真菌活性;經(jīng)鑒定此峰即家蠅抗真菌肽-1（Muscadomestica antifungal peptide，MAF-1）;2、通過(guò)圓二色譜測(cè)出水溶液中抗真菌肽MAF-1主要以α螺旋及β折疊為主，無(wú)規(guī)卷曲的構(gòu)象也存在;物理煮沸和化學(xué)變性劑SDS的加入，對(duì)β折疊結(jié)構(gòu)影響較大，活性相應(yīng)降低。

4、3、白假絲酵母菌經(jīng)抗真菌肽作用后，與對(duì)照相比紫外吸收值明顯升高，且隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，相應(yīng)的滲透率大幅度提高;4、掃描電鏡觀察結(jié)果顯示:經(jīng)抗真菌肽作用1h后的部分真菌出現(xiàn)表面凸凹不平，細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊;隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，表面形成很明顯的凹陷，皺縮，個(gè)別菌體破裂，原生質(zhì)嚴(yán)重?cái)U(kuò)散，內(nèi)容物外泄，病變真菌發(fā)生率高于對(duì)照組;5、單細(xì)胞凝膠電泳結(jié)果顯示:正常對(duì)照組的真菌呈現(xiàn)典型的圓形，而實(shí)驗(yàn)組則出現(xiàn)明顯的拖尾現(xiàn)象即形成“彗星”樣細(xì)胞特征，

5、即很小的彗星頭，大而圓的彗星尾，細(xì)胞遷移距離明顯高于對(duì)照組;6、電泳圖譜顯示，抗真菌肽MAF-1作用后的白假絲酵母菌菌體蛋白譜帶某些條帶明顯變淺，條帶數(shù)下降，甚至消失。
　　結(jié)論:1、通過(guò)圓二色譜測(cè)出水溶液中抗真菌肽MAF-1主要以α螺旋及β折疊為主，無(wú)規(guī)卷曲的構(gòu)象也存在;物理煮沸和化學(xué)變性劑SDS的加入，對(duì)β折疊結(jié)構(gòu)影響較大，活性相應(yīng)降低。2、通過(guò)電鏡，SCGE等方法研究抗真菌肽對(duì)白假絲酵母菌的作用機(jī)制，表明其可能使真菌表面形成