成釉細胞瘤相關基因的篩選和侵襲性生長的實驗研究.pdf

1、本研究擬從以下幾方面展開： 一、利用DNA微陣列技術篩選成釉細胞瘤相關基因； 二、用RT-PCR技術對成釉細胞瘤發(fā)生和發(fā)展密切相關的基因進行定量驗證； 三、對一些在其他腫瘤明確過度表達的基因，在AM中少見或未見有研究者(如EMMPRIN、CXCR4)進行初步研究，探討它們在成釉細胞瘤侵襲性與增殖活性和微血管密度的關系第一部分 DNA微陣列篩選成釉細胞瘤相關基因的研究研究目的： 成釉細胞瘤雖然是良性的上皮多

2、形性腫瘤，卻具有局部侵襲性生長和術后容易復發(fā)的生物學特征。目前有關其發(fā)病機理仍不清楚，而有關其遺傳生物學特征更是知之甚少。本實驗用生物芯片技術篩選成釉細胞瘤相關基因，以便比較全面的了解與成釉細胞瘤發(fā)生和發(fā)展有關的基因概貌，為深入研究成釉細胞瘤局部侵襲性生長尋找可靠的路徑。 材料和方法： 總RNA的提取和mRNA的純化： 分別從人成釉細胞瘤和16-18周人類胚胎的牙胚組織中提取總RNA(按標準Trizol試劑Gil

3、bco提取)并純化為mRNA(照Oligotex mRNA純化試劑盒說明書)。 cDNA芯片的制備： 包含有14000條已知的全長或部分序列的cDNA芯片由聯(lián)合基因公司提供(中國，上海)。芯片中所有目的基因經PCR擴增，擴增產物通過凝膠電泳驗證(在電泳成像儀上拍攝電泳圖譜，并用熱敏打印機打印出圖譜照片，質檢確認PcR產物的產量和質量)。PCR產物經純化、點樣、封閉制成芯片。兩種組織的mRNA分別逆轉錄合成有熒光分子標記的

4、探針，然后與含有14000種人類基因的芯片進行雜交，雜交信號用ScanArray4000 StandardBiochip Scanning System掃描儀掃描，結果用芯片圖象分析軟件(GenepixPro3.0)進行分析。 結論：運用DNA微陣列可以有效地篩選出成釉細胞瘤相關基因?？梢员容^全面的了解與成釉細胞瘤發(fā)生和發(fā)展有關的基因概貌，為深入研究成釉細胞瘤局部侵襲性生長尋找可靠的路徑。 第二部分成釉細胞瘤相關基因RT

5、-PCR檢測 研究目的:定量檢測TNF、Ras、CTGF3個基因mRNA在成釉細胞瘤中的表達水平，探討它們與成釉細胞瘤的相關關系，并進一步驗證我們在第一部分的研究結果。 材料與方法 用10對臨床配對成釉細胞瘤和正常牙囊組織，提取和純化mRNA，逆轉錄成cDNA，在測定最佳反應條件后，采用熒光實時定量PCR技術驗證候選基因的表達情況，結合內參照3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)管家基因進行相對定量分析。步驟如下1、

6、10對臨床配對成釉細胞瘤和正常牙囊組織，提取總RNA(按標準Trizol試劑Gilbco提取)并純化為mRNA(照Oligorex mRNA純化試劑盒說明書)。 2、設計并合成TNF、Ras和CTGF的Realtime PCR引物，由上海生物工程有限公司合成。 3、mRNA逆轉錄成cDNA： RNA3ul、隨機引物1ul、dNTPslul、DEPC水10.5ul65℃溫育10min后加入如下試劑： RNA

7、酶抑制劑0.5ul、Buffer2u1、DTTl ul、MMLV-RT，SPCLlul37℃孵育1h，75℃保溫10min滅活反轉錄酶．cDNA樣品于-20℃保存?zhèn)溆谩?4、檢測模板質量、測定內參GAPDH和最佳反應條件。 5、實時熒光定量PCR．結合內參照3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)管家基因進行相對定量分析。 6、結果和統(tǒng)計學分析。 結論: TNF、Ras是與成釉細胞瘤密切相關的基因，結締

8、組織生長因子可能與成釉細胞瘤有關。 第三部分成釉細胞瘤侵襲性與細胞外基質金屬蛋白酶誘導因子和微血管密度的關系 研究目的:檢測和比較成釉細胞瘤與牙源性頜骨囊腫組織中的細胞外基質金屬蛋白酶誘導因子(extracellular matrix metalloproteinase inducer，EMMPRIN)的表達和微血管分布情況，探討EMMPRIN對成釉細胞瘤進展過程中血管形成的影響。方法使用EMMPRIN多克隆抗體和CD3

9、4單克隆抗體，用SP法對41例成釉細胞瘤和40例牙源性頜骨囊腫組織進行免疫組化檢測，用Weider法對CD34染色陽性的細胞簇(微血管)密度計數。 結論: EMMPRIN可能通過調控細胞外基質中的基質金屬蛋白酶和微血管形成，對成釉細胞瘤進展過程產生作用。 第四部分趨化因子受體CXCR4與成釉細胞瘤增殖活性及微血管密度的關系 研究目的:探討CXCR4在成釉細胞瘤中的表達及其與微血管密度和成釉細胞瘤細胞增殖活

10、性的相互關系。 方法: 選取41例成釉細胞瘤和40例牙源性囊腫的石蠟塊標本，運用免疫組織化學SP方法檢測CXCR4、CD34和Ki-67在這兩種組織中的表達情況，參照有關文獻中提及的計數標準計算CXCR4和Ki-67在這兩種組織中的陽性表達率，以及Ki-67增殖指數和微血管密度。　　結論:1CXCR4在成釉細胞瘤和牙源性囊腫組織中均有表達，它們的陽性表達率分別是58.54％(24/41)和35％(14/40)：