基質(zhì)金屬蛋白酶-2靶向siRNA抑制成釉細(xì)胞瘤侵襲性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、 成釉細(xì)胞瘤(ameloblastoma,AM)是口腔頜面部最常見的牙源性腫瘤，占牙源性腫瘤的59.3％。AM雖為良性腫瘤，但具有局部侵襲性，腫瘤細(xì)胞常向骨小梁間侵潤(rùn)，臨床治療容易復(fù)發(fā)，其復(fù)發(fā)率高。反復(fù)多次手術(shù)給患者造成嚴(yán)重的面部畸形，并有可能惡變，因而研究其侵襲機(jī)制具有重要的意義。 到目前為止，成釉細(xì)胞瘤局部侵襲的機(jī)制尚未明了。一般認(rèn)為，腫瘤侵襲主要是指腫瘤細(xì)胞侵犯和破壞周圍正常組織的過程。腫瘤細(xì)胞的周邊為結(jié)締組織，即基

2、底膜和細(xì)胞外基質(zhì)，這些結(jié)構(gòu)的降解與破壞是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移多階段過程中的重要步驟。細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的主要組織結(jié)構(gòu)為膠原、層粘素和纖維結(jié)合素等，這些結(jié)構(gòu)的破壞與降解需要相應(yīng)的溶解酶參與。研究表明，基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinase，MMP)和相應(yīng)的金屬酶組織抑制劑在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中擔(dān)任了重要的角色。其中，基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)是目前研究發(fā)現(xiàn)的與腫瘤侵襲關(guān)系最為密切的一種基質(zhì)金屬蛋白酶。 已有

3、的研究表明，MMP的調(diào)節(jié)具有三個(gè)水平，即基因轉(zhuǎn)錄水平、酶原的活化激活水平、抑制劑水平?，F(xiàn)有的研究主要集中在后2個(gè)方面，而在MMP基因轉(zhuǎn)錄水平對(duì)MMP進(jìn)行調(diào)節(jié)的研究很少。近年來，出現(xiàn)了一種新的基因研究手段-RNA干擾(RNAinterference，RNAi)，它是將與mRNA對(duì)應(yīng)的正義RNA和反義RNA組成的雙鏈RNA導(dǎo)入細(xì)胞，使mRNA發(fā)生特異性的降解，導(dǎo)致其相應(yīng)的基因沉默。RNAi在研究基因功能、基因敲除、基因表達(dá)調(diào)控和基因治療方面

4、發(fā)揮著重要作用。 本研究旨在以MMP-2為靶基因，采用RNA干擾的方法沉默MMP-2基因，從而從MMP-2基因轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控MMP-2的表達(dá)，探討MMP-2基因沉默后AM細(xì)胞侵襲性生物學(xué)行為的改變，進(jìn)一步研究MMP-2與AM局部侵襲的關(guān)系。本研究分四部分，現(xiàn)摘要如下： 第一部分成釉細(xì)胞瘤原代細(xì)胞培養(yǎng)及生長(zhǎng)特性迄今為止，AM侵襲性生長(zhǎng)的機(jī)制尚未完全明確。為了研究其侵襲機(jī)制，采用體外培養(yǎng)的AM細(xì)胞進(jìn)行研究是一種重要的方法。由于

5、AM細(xì)胞在常規(guī)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)緩慢，存活時(shí)間短，不容易純化，不利于AM的細(xì)胞生物學(xué)研究。為了探索更為適合AM細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，本實(shí)驗(yàn)擬采用DK-SFM無血清培養(yǎng)基和DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)AM細(xì)胞，研究AM細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)特性，為進(jìn)一步研究AM的細(xì)胞生物學(xué)行為奠定基礎(chǔ)。 方法：采用DK-SFM無血清培養(yǎng)基和DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)AM細(xì)胞，CK14、CK16、CK18及Vimentin免疫組織化學(xué)染色鑒定細(xì)胞來源，觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)特性、

6、細(xì)胞形態(tài)和傳代次數(shù)，流式細(xì)胞儀測(cè)定S期細(xì)胞比率(SPF)和增殖指數(shù)(PI)。結(jié)果：體外培養(yǎng)的AM細(xì)胞CK14、CK16免疫組化染色陽性，CK18及Vimentin免疫組化染色陰性。在DK-SFM培養(yǎng)基中，細(xì)胞形態(tài)清晰，僅見少許散在的成纖維細(xì)胞；細(xì)胞傳代3-6次，平均傳代4.8代；細(xì)胞存活48-97d，平均存活73.8d；SPF平均值為6.8％，PI平均值為15.9％。在DMEM中，細(xì)胞形態(tài)不清晰，可見較多的成纖維細(xì)胞；細(xì)胞傳代2-4次，

7、平均傳代3.2代；細(xì)胞存活27-61d，平均存活46.7d；SPF平均值為5.4％，PI平均值為11.0％。結(jié)論：在DK-SFM中培養(yǎng)的AM細(xì)胞存活時(shí)間長(zhǎng)，傳代次數(shù)較多，DK-SFM較DMEM更適合AM細(xì)胞的體外培養(yǎng)。 第二部分MMP-2靶向siRNA表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及序列優(yōu)化RNA干擾是生物進(jìn)化過程中抵抗病毒和轉(zhuǎn)座子的一種保守防御反應(yīng)。它是由正義RNA和反義RNA組成的雙鏈RNA在細(xì)胞內(nèi)被Dicer酶切割成約19～22nt的si

8、RNA，進(jìn)而形成siRNA蛋白復(fù)合物(siRNP)，siRNP通過識(shí)別、降解具有同源序列的mRNA，最終導(dǎo)致特異性的基因表達(dá)沉默，屬于轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制。當(dāng)進(jìn)行RNA干擾實(shí)驗(yàn)研究時(shí)，需要制備siRNA，目前，siRNA的制備的方法有體外制備法和體內(nèi)表達(dá)法兩種。前者是在體外合成siRNA，再導(dǎo)入siRNA于細(xì)胞內(nèi)，該法存在基因沉默維持時(shí)間短、轉(zhuǎn)染效果不穩(wěn)定等問題。后者是在體外構(gòu)建siRNA表達(dá)載體，如質(zhì)粒載體或病毒載體，載體導(dǎo)入體內(nèi)后自動(dòng)

9、合成siRNA，引發(fā)基因沉默，該法的基因沉默時(shí)間長(zhǎng)、轉(zhuǎn)染效果穩(wěn)定。因此，本實(shí)驗(yàn)將構(gòu)建MMP-2特異性siRNA表達(dá)質(zhì)粒，并優(yōu)化特異性序列，為MMP-2基因相關(guān)的后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。 方法：采用定向克隆的方法構(gòu)建P1、P2共2條MMP-2特異性siRNA表達(dá)質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，采用熒光顯微鏡觀察其轉(zhuǎn)染效果，流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，RT-PCR檢測(cè)MMP-2mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果：構(gòu)建的2條MMP-2特異性siRNA表達(dá)

10、質(zhì)粒經(jīng)基因測(cè)序顯示克隆的序列完全正確，2條siRNA表達(dá)質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，72h時(shí)，P1的轉(zhuǎn)染效率為41.8％，P2的轉(zhuǎn)染效率為93.2％，P2的轉(zhuǎn)染效率大于P1的轉(zhuǎn)染效率，差異具有顯著性，P＜0.05；72h時(shí)，P1、P2對(duì)MMP-2mRNA的沉默效率分別為38.6％、68.9％。結(jié)論：體外構(gòu)建的MMP-2靶向siRNA表達(dá)質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞并有效沉默MMP-2基因，但有序列差異性，P2的轉(zhuǎn)

11、染效率和基因沉默效率優(yōu)于P1。 第三部分MMP-2靶向siRNA對(duì)成釉細(xì)胞瘤侵襲性的抑制作用MMP-2的表達(dá)與活性調(diào)節(jié)一般有三個(gè)水平，即基因轉(zhuǎn)錄水平、酶原的活化激活、抑制劑水平。在本課題組的前期研究中，應(yīng)用MMP-2特異性抑制劑Ro31-9790明顯抑制了MMP-2的活性，使裸鼠腎包膜下的AM移植瘤的生長(zhǎng)被抑制，這種對(duì)MMP-2的調(diào)節(jié)是在抑制劑水平上的調(diào)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)擬以第二部分構(gòu)建的MMP-2靶向siRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染AM細(xì)胞，以

12、沉默MMP-2基因的表達(dá)。從而從MMP-2基因轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控MMP-2的表達(dá)，探討MMP-2基因沉默后AM細(xì)胞侵襲性生物學(xué)行為的改變，進(jìn)一步研究AM局部侵襲性生長(zhǎng)的機(jī)制。 方法：采用第一部分的無血清培養(yǎng)法培養(yǎng)AM細(xì)胞，將體外構(gòu)建的MMP-2靶向siRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染AM細(xì)胞，熒光顯微鏡檢測(cè)siRNA表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效果，流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率及細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡情況，明膠酶譜分析法檢測(cè)培養(yǎng)上清液中MMP-2的活性，RT-PCR檢測(cè)M

13、MP-2mRNA表達(dá)的改變，Westernblotting印跡法檢測(cè)AM細(xì)胞MMP-2蛋白表達(dá)，三維培養(yǎng)檢測(cè)AM細(xì)胞的侵襲性，Transwell微侵襲分析檢測(cè)細(xì)胞的侵襲抑制率，細(xì)胞黏附分析法檢測(cè)細(xì)胞在Fn基質(zhì)上的黏附率。采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果：siRNA表達(dá)質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染AM細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞周期無明顯改變；96h時(shí)，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染率為63.6％，培養(yǎng)上清液中酶原性MMP-2和活性MMP-2的表達(dá)分別下降了39

14、.6％和56.5％；轉(zhuǎn)染96h后，AM細(xì)胞的MMP-2mRNA表達(dá)水平下降了66.0％，MMP-2蛋白表達(dá)下降64.6％，細(xì)胞的侵襲抑制率為61.3％，黏附抑制率為48.3％，P＜0.05。結(jié)論：MMP-2靶向siRNA成功轉(zhuǎn)染AM細(xì)胞并沉默MMP-2基因，抑制了MMP-2基因的表達(dá)，AM的侵襲性被明顯抑制，MMP-2與AM細(xì)胞的侵襲性密切相關(guān)。 第四部分MMP-2靶向siRNA對(duì)成釉細(xì)胞瘤裸鼠移植瘤的抑制作用通過前面的實(shí)驗(yàn)研究

15、，我們已經(jīng)證明MMP-2靶向siRNA可以在體外沉默MMP-2基因從而抑制MMP-2基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制了AM細(xì)胞的侵襲性。為了進(jìn)一步探討RNA干擾在生物體內(nèi)的效應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)旨在構(gòu)建AM移植瘤模型，通過在移植瘤周圍局部注射MMP-2靶向siRNA表達(dá)質(zhì)粒，探討體內(nèi)RNA干擾對(duì)AM侵襲生的抑制作用。 方法：取新鮮的AM組織標(biāo)本，剪切成1-2mm3組織小塊，接種于裸鼠雙側(cè)前肢根部背側(cè)和后背部皮下。設(shè)立自身對(duì)照，即左側(cè)前肢處的移植瘤為空

16、白組，注射250μlOptiMEMR培養(yǎng)基；后背部的移植瘤為脂質(zhì)體組，在移植瘤周圍注射脂質(zhì)體混合物，空白組和脂質(zhì)體組均為對(duì)照組，右側(cè)前肢處的移植瘤為siRNA組，在移植瘤周圍注射MMP-2靶向siRNA表達(dá)質(zhì)?；旌衔?；接種后第2周末開始施加處理因素，記錄移植瘤體積和實(shí)驗(yàn)終止時(shí)的瘤重，采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件包中的t檢驗(yàn)法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行檢驗(yàn)，P＜0.05表示有顯著性差異。RT-PCR檢測(cè)移植瘤中MMP-2mRNA的表達(dá)，Westernblotti

17、ng檢測(cè)移植瘤中MMP-2蛋白的表達(dá)，并對(duì)移植瘤進(jìn)行組織病理學(xué)分析。結(jié)果：所有移植瘤均成活，實(shí)驗(yàn)組移植瘤體積增加量少于對(duì)照組移植瘤體積的增加量，實(shí)驗(yàn)組移植瘤的瘤重少于對(duì)照組移植瘤的瘤重，差異有顯著性，P＜0.05。對(duì)照組移植瘤周邊的疏松結(jié)締組織中都出現(xiàn)了AM濾泡樣結(jié)構(gòu)，濾泡樣結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)典型的V-G三聯(lián)征，實(shí)驗(yàn)組移植瘤周邊的疏松結(jié)締組織中沒有AM濾泡樣結(jié)構(gòu)或僅僅殘留濾泡樣結(jié)構(gòu)的痕跡。對(duì)照組MMP-2mRNA和MMP-2蛋白的表達(dá)水平均顯著性