芪葵顆粒對趨化因子FKN在糖尿病腎病中表達(dá)影響的研究.pdf

1、糖尿病是呈逐年增長的內(nèi)分泌代謝疾病，其中約1/3患者最終發(fā)展為糖尿病腎病(DN)。DN是一種典型的糖尿病微血管并發(fā)癥，它的病變位置是腎臟，主要影響腎臟微血管，進而導(dǎo)致腎小球硬化。糖尿病腎病發(fā)病過程呈持續(xù)進展性，伴隨著腎功能逐漸衰竭，最終導(dǎo)致死亡。很多的學(xué)者發(fā)現(xiàn)DN的發(fā)生、發(fā)展過程受炎癥機制影響，趨化因子及其受體是炎癥細(xì)胞相互作用及募集的關(guān)鍵因素。Fractalkine(FKN)是目前CX3C類趨化因子中惟一的成員，具有趨化及粘附功能，參

2、與白細(xì)胞特別是吞噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的游走和活化，在DN的早期階段有重要的作用。
　　目的:
　　通過建立糖尿病腎病大鼠模型，觀察芪葵顆粒對糖尿病腎病(DN)大鼠的腎臟組織及高糖培養(yǎng)后的人腎系膜細(xì)胞（HRMC）中趨化因子FKN表達(dá)影響，探討其在治療糖尿病腎病時所可能產(chǎn)生的機制，為臨床治療糖尿病腎病提供實驗依據(jù)。
　　方法:
　　1.體內(nèi)實驗:使用35只健康雄性4周齡SD大鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，高脂飼料喂養(yǎng)1月，造模前禁

3、食12h。隨機分為正常對照組（A組，n=8），糖尿病模型組（B組，n=9），中藥芪葵顆粒干預(yù)治療組（C組，n=9）及西藥厄貝沙坦干預(yù)組（D組，n=9）。B組、C組及D組大鼠予一次性腹腔注射大劑量鏈脲佐菌素(STZ)進行誘導(dǎo)，建立DM大鼠模型，對照組A組大鼠腹腔注射等體積檸檬酸鹽緩沖液。造模成功后繼續(xù)飼養(yǎng)3個月，測尿蛋白陽性作為作為DN模型成功指標(biāo)。每日用芪葵顆粒和厄貝沙坦分別對中藥組大鼠和厄貝沙坦組大鼠進行灌胃干預(yù)。之后每2周測體重、血

4、糖一次。于實驗第12周后，用代謝籠收集24h尿量，進行尿蛋白測定及尿生化。然后處死大鼠，采取頸動脈血測定腎功能，稱量腎重，觀察腎組織形態(tài)變化，采用RT-PCR方法、Western blot檢測法及免疫組織化法觀察糖尿病腎病大鼠腎臟的Fractalkine mRNA及蛋白的表達(dá)。
　　2.體外實驗:制備含藥血清，將HRMC分為A組、B組、C組進行培養(yǎng)。A組（生藥組）包括:NG(5mmol/L GLU)，Man（5mmol/l GLU

5、+25mmol/l甘露醇），HG（30mmol/l GLU），S2（30mmol/l GLU+2mg/ml生藥），S1(30mmol/lGLU+1mg/ml生藥)，S0.5（30mmol/L GLU+0.5mg/ml生藥）。B組（10％含藥血清組）包括:NLG1(10％正常血清+5mmol/l GLU)、NHG1(10％正常血清+30mmol/l GLU)、LLG1(10％低劑量含藥血清+5mmol/l GLU)、LHG1(10％低劑量

6、含藥血清+30mmol/l GLU)、HLG1(10％高劑量含藥血清+5mmol/lGLU)、HHG1（10％高劑量含藥血清+30mmol/l GLU）。C組（20％含藥血清組）包括:NLG2(20％正常血清+5mmol/l GLU)、NHG2(20％正常血清+30mmol/l GLU)、LLG2（20％低劑量含藥血清+5mmol/l GLU）、LHG2(20％低劑量含藥血清+30mmol/l GLU)、HLG2(20％高劑量含藥血清+

7、5mmol/lGLU)、HHG2(20％高劑量含藥血清+30mmol/l GLU)。使用western blot檢測法觀察高糖培養(yǎng)24h后Fractalkine蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.體內(nèi)實驗糖尿病腎病組大鼠24h尿蛋白、尿微量白蛋白/肌酐、腎重、腎重/體重比值、尿素氮、肌酐與正常對照組比較明顯升高，差異有顯著性(P＜0.05);中藥治療組大鼠的尿蛋白、尿微量白蛋白/肌酐、腎重、腎重/體重比值、尿素氮、肌酐與同期糖

8、尿病腎病模型組大鼠相比明顯減少，具有顯著性差異(P＜0.05);厄貝沙坦組較模型組相比均明顯降低(P＜0.05);中藥組與厄貝沙坦組相比無明顯差異。給予芪葵顆粒治療后的腎皮質(zhì)FKN表達(dá)較模型組明顯下降(P＜0.05)。腎臟免疫組化結(jié)果示:中藥芪葵顆粒干預(yù)后的腎小球及腎小管間質(zhì)Fractalkine的表達(dá)量和模型組明顯減少，而中藥組和厄貝沙坦組相比較(P＞0.05)，無明顯差異。
　　2.體外實驗提示A組（生藥組）:與NG相比，F(xiàn)K

9、N蛋白表達(dá)在HG中明顯升高(P＜0.05);S2較HG的FKN蛋白表達(dá)升高(P＜0.05); Man和NG、HG中FKN蛋白表達(dá)相比無明顯差異;S1、S0.5和HG相比均無明顯差異。B組(10％含藥血清組):HHG1 Fractalkine蛋白表達(dá)水平較NHG1明顯降低(P＜0.05); HLG1fractalkine蛋白分泌較NLG1明顯降低(P＜0.05)。C組（20％含藥血清組）:HLG2Fractalkine蛋白分泌較NLG2明

10、顯升高(P＜0.05);與NHG2相比，HHG2 Fractalkine蛋白表達(dá)及分泌水平明顯降低(P＜0.05)
　　結(jié)論:
　　1.Fractalkine在糖尿病腎病組織中表達(dá)明顯增強，推測該趨化因子在DN炎癥反應(yīng)中起重要作用;2.中藥芪葵顆粒組與DM組相比，明顯降低糖尿病腎病大鼠的腎重/體重、尿蛋白、血肌酐、血糖，減少Fractalkine mRNA及蛋白的表達(dá)，推測芪葵顆粒對腎臟保護作用可能是通過下調(diào)Fractalk