黃芩苷抑制牙周炎牙槽骨吸收的作用及機(jī)理研究.pdf

1、牙周炎的破壞過程，是菌斑和宿主之間通過復(fù)雜的分子機(jī)制相互作用的結(jié)果。宿主的防御過程分為非特異性的炎癥反應(yīng)和特異性的免疫應(yīng)答反應(yīng)（包括體液免疫、細(xì)胞免疫和補(bǔ)體系統(tǒng)）。牙周炎可以說是一種由細(xì)菌引起的免疫炎癥性疾病，它的發(fā)生、發(fā)展與免疫細(xì)胞及其相關(guān)因子的參與有關(guān)。
　　牙槽骨吸收是牙周炎的主要病理變化之一。在牙周炎的治療中，主要為控制或消除炎癥并促進(jìn)組織再生。應(yīng)用藥物控制炎癥、阻斷牙槽骨吸收和促進(jìn)骨再生是不可缺少的一種治療方法。一些中草

2、藥的提取物或單體被證實(shí)具有抗炎和直接或間接的抑制破骨細(xì)胞分化和功能的作用。
　　黃芩苷(baicalin)是由唇形科植物黃芩(ScutellariabaicalensiGeorgi)的干燥根中提取的一種黃酮類化合物。黃芩苷是黃芩及其制劑的主要質(zhì)量控制指標(biāo)成分。據(jù)藥理學(xué)研究報道,黃芩苷具有顯著的抗炎作用，可抑制促進(jìn)破骨細(xì)胞活化和功能的各種因子的產(chǎn)生。一系列的研究提示黃芩苷在牙周病的防治方面具有一定的應(yīng)用前景。但其在藥理作用的機(jī)理研究

3、方面尚有很多工作要做。
　　牙周炎時，T細(xì)胞數(shù)量、活性增高，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞因子分泌增加，加重牙周炎癥和骨吸收。TGF-β可以抑制T細(xì)胞的活性和增殖。因而設(shè)想黃芩苷的抗炎抗骨吸收的作用可能通過TGF-β起作用，而巨噬細(xì)胞是分泌TGF-β的主要來源。故此，我們提出黃芩苷抑制牙周炎牙槽骨吸收的機(jī)理可能是：通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌TGF-β，從而抑制T細(xì)胞的活性、增殖和數(shù)量，導(dǎo)致T細(xì)胞產(chǎn)生的TNF等炎性因子減少，進(jìn)一步引起RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)

4、胞形成減少，從而使牙槽骨喪失減緩或停止，牙周炎癥減輕。
　　本實(shí)驗(yàn)的目的：①通過動物實(shí)驗(yàn)，從Micro-CT和組織學(xué)的角度研究黃芩苷對實(shí)驗(yàn)性牙周炎牙槽骨吸收的影響；②研究黃芩苷對巨噬細(xì)胞分泌TGF-β1的影響；③利用基因干涉技術(shù)，將TGF-β基因沉默。研究當(dāng)TGF-β基因沉默后，黃芩苷是否能夠使牙周膜成纖維細(xì)胞分泌RANKL/OPG的比值降低。從而證實(shí)黃芩苷是否通過TGF-β抑制T細(xì)胞的活性、增殖和數(shù)量，導(dǎo)致T細(xì)胞產(chǎn)生的TNF等炎

5、性因子減少，進(jìn)一步使牙周膜成纖維細(xì)胞分泌RANKL/OPG的比值降低。初步揭示黃芩苷的作用機(jī)理，為將黃芩苷應(yīng)用于牙周病的防治提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　一．黃芩苷對實(shí)驗(yàn)性牙周炎牙槽骨吸收的影響
　　建立大鼠牙周炎模型，局部注射黃芩苷，利用micro-CT和組織學(xué)檢查觀察黃芩苷對實(shí)驗(yàn)性牙周炎牙槽骨吸收的影響。micro-CT構(gòu)建出大鼠牙槽骨結(jié)構(gòu)的計算機(jī)三維圖像數(shù)據(jù)集，得到良好的視覺效果的同時測定骨小梁的三維結(jié)構(gòu)參數(shù)，從而獲得黃芩

6、苷抑制大鼠牙周炎牙槽骨吸收的更為直觀和確切的證據(jù)。結(jié)果證實(shí)黃芩苷可以有效的抑制LPS誘導(dǎo)的大鼠牙周炎牙槽骨的吸收，1.0μｇ/ｍｌ的黃芩苷較之0.1μｇ/ｍｌ的黃芩苷具有更好的效果。
　　二.黃芩苷對巨噬細(xì)胞分泌TGF-β1的影響
　　體外分離培養(yǎng)人巨噬細(xì)胞,將不同濃度的黃芩苷加入培養(yǎng)液，48h后用RT-PCR、Westernblot技術(shù)檢測各組細(xì)胞TGFβ1表達(dá)情況。發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞在不同濃度黃芩苷的作用下,TGFβ1mRNA

7、的表達(dá)和蛋白表達(dá)均隨黃芩苷濃度的增加而增加(P<0.05)。其中,1.0μｇ/ｍｌ濃度黃芩苷作用最為顯著。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了黃芩苷可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TGFβ1。
　　三.TGF-βⅡR特異性siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定
　　根據(jù)GeneBank中報道的TGFβⅡR核苷酸序列，參考siRNA的設(shè)計原則，按照pSilencer3.1H1載體的設(shè)計要求，設(shè)計2條siRNA序列。合成的單鏈寡核苷酸鏈經(jīng)退火、磷酸化后形成雙鏈DNA，定向

8、插入pSilencer3.1H1載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞增菌后提取質(zhì)粒。DNA測序證實(shí)該重組質(zhì)粒序列與所設(shè)計序列完全一致，表明針對TGF-βⅡR基因的siRNA表達(dá)載體已構(gòu)建成功。為下一步研究工作的開展奠定了良好基礎(chǔ)。
　　四.siRNA轉(zhuǎn)染T細(xì)胞并鑒定
　　用成功構(gòu)建的2種針對HBV基因的siRNA表達(dá)載體pSilencer3.1H1-TGF-βⅡR（1-2）轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)TGF-βⅡR的T細(xì)胞，經(jīng)潮霉素篩選獲得穩(wěn)定的單克隆細(xì)胞

9、株。篩選出的單克隆細(xì)胞的流式細(xì)胞分析結(jié)果和細(xì)胞生長曲線顯示，細(xì)胞周期、增殖指數(shù)以及細(xì)胞生長速度與對照無顯著差異，提示導(dǎo)入TGF-βⅡR特異性siRNA表達(dá)載體對T細(xì)胞的生長無明顯影響。RT-PCR結(jié)果證實(shí)siRNA能降低TGF-βⅡRmRNA的表達(dá)。Westernblot結(jié)果證實(shí)siRNA能抑制T細(xì)胞內(nèi)TGF-βⅡR蛋白的合成。
　　五.黃芩苷對牙周膜細(xì)胞OPG-RANKL表達(dá)的影響
　　將正常牙周膜成纖維細(xì)胞與轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染

10、siRNA的T細(xì)胞置于加有內(nèi)毒素和黃芩苷的培養(yǎng)液中，分為6組，觀察黃芩苷對正常牙周膜成纖維細(xì)胞上OPG-RANKL表達(dá)的影響。研究結(jié)果證實(shí)黃芩苷可以降低PDLC表面RANKL/OPG比值，同時表明TGF-β的信號傳導(dǎo)在黃芩苷影響PDLC表面的RANKL/OPG比值的過程中起到重要的作用。分析認(rèn)為黃芩苷可能通過增強(qiáng)TGF-β對T細(xì)胞的抑制作用，引起T細(xì)胞活性降低、數(shù)量減少，導(dǎo)致T細(xì)胞在內(nèi)毒素作用下分泌的TNF-α等炎癥因子減少，降低RAN

11、KL/OPG比值，進(jìn)而降低破骨細(xì)胞形成，減少骨丟失，降低牙周炎進(jìn)展的危險因素。本研究還發(fā)現(xiàn)黃芩苷除了通過TGFβ途徑外，還可能有其他的通路對PDLC表面的RANKL/OPG進(jìn)行調(diào)控。
　　結(jié)論：黃芩苷可以有效的抑制牙周炎牙槽骨的吸收。其作用機(jī)制可能為：黃芩苷促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌TGF-β，從而抑制T細(xì)胞的活性、增殖和數(shù)量，導(dǎo)致T細(xì)胞產(chǎn)生的TNF等炎性因子減少，進(jìn)一步引起RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成減少，從而使牙槽骨喪失減緩或停止，牙周