CD4+T細(xì)胞在吸煙相關(guān)性牙周炎牙槽骨骨吸收作用機(jī)制研究.pdf

1、牙周炎是口腔常見疾病之一,是一種以牙齒支持和連接組織喪失為特征的慢性感染性疾病,是包括菌斑在內(nèi)的局部刺激因素引起的直接細(xì)胞毒作用及蛋白分解作用,以及宿主對(duì)持續(xù)存在菌斑微生物的免疫應(yīng)答所引起間接損傷的結(jié)果。牙周炎病因不明,近來大量研究表明,自身免疫反應(yīng)在牙周炎發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用,而CD4~+T細(xì)胞,即輔助性T細(xì)胞(T helper, Th),作為機(jī)體免疫調(diào)節(jié)中的核心細(xì)胞,在機(jī)體免疫應(yīng)答中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。牙周炎的全身易感因素包括遺傳

2、因素、性激素、吸煙及有關(guān)的系統(tǒng)性疾病等,其中關(guān)于吸煙影響牙周炎發(fā)生發(fā)展的研究較多,但其具體機(jī)制仍不明確。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)在大鼠牙周組織和人牙周膜細(xì)胞(human periodontalligament cells, hPDLCs)存在煙堿型乙酰膽堿受體α7亞型(alpha7nicotinicacetylcholine receptor,α7nAChR)的功能性表達(dá),尼古丁作用后,α7nAChR表達(dá)升高,這一效應(yīng)可以被特異性拮抗劑α-銀

3、環(huán)蛇毒素(α-bungarotoxin,α-BTX)所拮抗。另有研究表明,尼古丁、α7nAChR與CD4~+T細(xì)胞之間存在著密切的聯(lián)系。這些研究為我們研究尼古丁在牙周炎發(fā)生發(fā)展中的作用提供了新的思路:尼古丁激活人牙周膜細(xì)胞膜上α7nAChR后是否會(huì)通過CD4~+T細(xì)胞進(jìn)一步對(duì)牙周組織產(chǎn)生破壞作用?其免疫分子機(jī)制是什么?目前尚未見相關(guān)報(bào)道。
　　本研究將深入探討CD4~+T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)與吸煙相關(guān)性牙周炎的密切關(guān)系,以期闡明機(jī)體

4、的免疫應(yīng)答在吸煙相關(guān)性牙周炎發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的作用。
　　實(shí)驗(yàn)一人牙周膜細(xì)胞的體外培養(yǎng)及CD4~+T細(xì)胞的分選1材料與方法:
　　取因正畸減數(shù)拔除的健康無齲第一前磨牙,無菌條件下采用組織塊法進(jìn)行原代培養(yǎng);待組織塊周圍爬出細(xì)胞并增殖后,常規(guī)傳代,用于下一步實(shí)驗(yàn)。抽取健康成年非吸煙志愿者外周靜脈血10ml,密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞,CD4-FITC抗體染色,孵育,流式細(xì)胞儀分選CD4~+T細(xì)胞。
　　結(jié)果:組織塊培養(yǎng)約八

5、天后,其邊緣陸續(xù)有成纖維樣細(xì)胞爬出,傳代后顯微鏡下觀察細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形,貼壁生長(zhǎng),輪廓清晰,排列成放射狀。抽取外周血,密度梯度離心法成功分離單個(gè)核細(xì)胞,顯微鏡下觀察,細(xì)胞形態(tài)呈圓形,在培養(yǎng)液中懸浮生長(zhǎng);CD4-FITC抗體染色,孵育,流式細(xì)胞儀分選,成功分選CD4~+T細(xì)胞:分選前,CD4~+T細(xì)胞在體系中約占33.3％,分選后,CD4~+T細(xì)胞在體系中約占98.2％。3結(jié)論體外成功培養(yǎng)hPDLCs,成功分選出CD4~+T細(xì)胞,建立實(shí)驗(yàn)所需

6、的細(xì)胞模型。實(shí)驗(yàn)二尼古丁對(duì)與/不與CD4~+T細(xì)胞共培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞M-CSF、RANKL及OPG表達(dá)的影響1材料與方法選取第5代hPDLCs接種于六孔板,分別給予激動(dòng)劑尼古丁(10-5M)和/或拮抗劑α-BTX(10-8M);采用實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞M-CSF、RANKL和OPG的mRNA和蛋白表達(dá)情況。2結(jié)果實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明:非共培養(yǎng)條件下,與對(duì)照組相比,10-5M尼古丁明顯上調(diào)人牙周膜細(xì)胞

7、RANKL、M-CSF mRNA表達(dá),明顯下調(diào)OPGmRNA表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與非共培養(yǎng)組相比,共培養(yǎng)條件下10-5M尼古丁進(jìn)一步上調(diào)人牙周膜細(xì)胞RANKL mRNA表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),M-CSF、OPG mRNA表達(dá)水平與非共培養(yǎng)組類似,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);Western blot的結(jié)果表明:非共培養(yǎng)條件下,10-5M尼古丁明顯上調(diào)人牙周膜細(xì)胞RANKL蛋白表達(dá),明顯下調(diào)OPG蛋

8、白表達(dá)(P＜0.05);與非共培養(yǎng)組相比,共培養(yǎng)條件下10-5M尼古丁進(jìn)一步上調(diào)人牙周膜細(xì)胞RANKL蛋白表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),OPG蛋白表達(dá)水平與非共培養(yǎng)組類似,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論:PCR和Western blot的結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,尼古丁作用后,RANKL、M-CSF的表達(dá)升高,OPG的表達(dá)降低,RANKL/OPG比值升高;與CD4~+T細(xì)胞共培養(yǎng)后RANKL的表達(dá)進(jìn)一步升高,

9、OPG表達(dá)水平與非共培養(yǎng)組類似,RANKL/OPG比值進(jìn)一步升高;說明尼古丁可上調(diào)人牙周膜細(xì)胞促進(jìn)破骨細(xì)胞分化細(xì)胞因子的表達(dá),下調(diào)抑制破骨細(xì)胞分化細(xì)胞因子的表達(dá),增強(qiáng)其誘導(dǎo)骨吸收的能力;與CD4~+T細(xì)胞共培養(yǎng)后,可能通過它們之間的相互作用,進(jìn)一步增強(qiáng)其誘導(dǎo)骨吸收的能力。實(shí)驗(yàn)三尼古丁對(duì)與/不與hPDLCs共培養(yǎng)CD4~+T細(xì)胞遷移能力的影響1材料與方法選取狀態(tài)良好的CD4~+T細(xì)胞接種于24孔板,分別給予α7nAChR激動(dòng)劑尼古丁(10

10、-5M)和/或拮抗劑α-BTX(10-8M),利用Transwell遷移小室觀察尼古丁作用下CD4~+T細(xì)胞遷移能力改變。
　　結(jié)果:
　　Transwell遷移實(shí)驗(yàn)表明:非共培養(yǎng)條件下,與對(duì)照組相比,10-5M尼古丁明顯增強(qiáng)CD4~+T細(xì)胞遷移能力,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),α-BTX+尼古丁處理組CD4~+T細(xì)胞遷移能力與對(duì)照組類似,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);與非共培養(yǎng)組相比,共培養(yǎng)條件下,10-5M尼古

11、丁進(jìn)一步增強(qiáng)CD4~+T細(xì)胞遷移能力,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),α-BTX+尼古丁處理組細(xì)胞遷移能力與非共培養(yǎng)組類似,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　Transwell遷移實(shí)驗(yàn)顯示:與對(duì)照組相比,尼古丁可明顯增強(qiáng)CD4~+T細(xì)胞遷移能力;與hPDLCs共培養(yǎng)后,CD4~+T細(xì)胞的遷移能力進(jìn)一步增強(qiáng);說明尼古丁可促進(jìn)CD4~+T細(xì)胞的遷移,提示可能會(huì)加重局部炎性反應(yīng),與hPDLCs共培養(yǎng)后,可能通過