重建心臟生物起搏器模型的體外研究.pdf

1、目的：研究超極化激活環(huán)核苷酸門控陽離子通道基因亞型4(HCN4)改造的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)與心室肌細(xì)胞共培養(yǎng)，構(gòu)建具有自律性的心臟生物起搏器模型的可行性；并研究MSC中過表達(dá)連接蛋白45(CX45)對(duì)以上生物起搏器模型自律性的影響。
　　 方法：
　　 1)體外分離培養(yǎng)新生大鼠的心室肌細(xì)胞，鑒定純度及活力；并通過膜片鉗方法記錄心肌細(xì)胞的自發(fā)性動(dòng)作電位。
　　 2)基因克隆的方法構(gòu)建包含HCN4基因的穿

2、梭質(zhì)粒pCDHI-GFP-HCN4，并通過四質(zhì)粒系統(tǒng)包裝成慢病毒顆粒，轉(zhuǎn)染大鼠的MSCs，構(gòu)建成HCN4?MSCs；將僅轉(zhuǎn)染有GFP基因的慢病毒顆粒的MSCs設(shè)為HCN4?MSCs。通過RT-PCR，以及熒光觀察鑒定HCN4基因在MSCs中的表達(dá)；電壓鉗記錄陽性轉(zhuǎn)染細(xì)胞的起搏電流If。
　　 3)將HCN4?MSCs與乳鼠心室肌細(xì)胞共培養(yǎng)構(gòu)建心臟生物起搏器模型，同時(shí)將HCN4?MSCs與心肌細(xì)胞共培養(yǎng)設(shè)為“HCN4?MSCs對(duì)照

3、組”。為了監(jiān)測(cè)生物起搏器的自律性，初步分析自律性變化的原因，計(jì)數(shù)心室肌細(xì)胞自發(fā)搏動(dòng)頻率、記錄自發(fā)性動(dòng)作電位；并通過免疫熒光標(biāo)記等方法鑒定共培養(yǎng)的兩類細(xì)胞間連接蛋白43(CX43)的表達(dá)；加入縫隙連接阻斷劑甘珀酸驗(yàn)證縫隙連接在模型中的價(jià)值。
　　 4)為了構(gòu)建CX45基因穩(wěn)定表達(dá)的MSCs細(xì)胞株，首先通過基因克隆的手段構(gòu)建含有CX45基因的表達(dá)質(zhì)粒pDsRED2-N1-RFP/Gja7，通過脂質(zhì)體2000的介導(dǎo)將pDsRED2-N

4、1-RFP/Gja7轉(zhuǎn)染MSCs,G418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株CX45?MSCs;同時(shí)將pDsRED2-N1-RFP空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的MSCs設(shè)為CX45 MSCs。為了鑒定MSCs中CX45基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)行了RT-PCR試驗(yàn)：CX43與CX45單克隆抗體免疫雙標(biāo)MSCs，鑒定CX45?MSCs中連接蛋白類型的變化。
　　 5)將CX45?MSCs作為生物起搏的載體細(xì)胞，轉(zhuǎn)染HCN4基因，構(gòu)建HCN4?CX45?MSCs;將HCN

5、4?CX45?MSCs與乳鼠心室肌細(xì)胞共培養(yǎng)重新構(gòu)建心臟生物起搏器；同時(shí)將CX45?MSCs中轉(zhuǎn)染HCN4基因，與心肌細(xì)胞共培養(yǎng)后構(gòu)建的生物起搏器模型設(shè)為“HCN4?CX45?MSCs對(duì)照組”。通過記錄共培養(yǎng)體系中乳鼠心室肌細(xì)胞自發(fā)搏動(dòng)頻率以及動(dòng)作電位特征的改變，監(jiān)測(cè)生物起搏器的自律性；免疫雙標(biāo)鑒定共培養(yǎng)的兩類細(xì)胞間CX43和CX45的表達(dá)；了解縫隙連接阻斷劑甘珀酸對(duì)該生物起搏器模型自律性的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1

6、)該方案分離培養(yǎng)的新生大鼠心室肌細(xì)胞消化瞬時(shí)的活細(xì)胞率為80％；培養(yǎng)至第5天時(shí)85％左右的心肌細(xì)胞都有自發(fā)性搏動(dòng)，搏動(dòng)頻率80次/min左右；培養(yǎng)至第9天后心肌細(xì)胞純度開始大大降低；培養(yǎng)5天心肌細(xì)胞的自發(fā)性動(dòng)作電位閾電位為—60mV,頻率84±12次/分，節(jié)律不規(guī)則。
　　 2)通過酶切鑒定以及基因測(cè)序證實(shí)HCN4基因成功構(gòu)建到pCDHl-MCSl-EFI-copGFP質(zhì)粒中，形成包含目的基因的穿梭質(zhì)粒pCDHl-GFP-HCN

7、4;通過穿梭質(zhì)粒的介導(dǎo)成功將HCN4基因包裝成慢病毒載體Ientiv-GFP/HCN4，real-timePCR測(cè)定lentiv-GFP/HCN4滴度為3×10?TU/mL。通過慢病毒載體介導(dǎo)HCN4基因轉(zhuǎn)染MSCs，5天后，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染陽性率約70％;RT-PCR證實(shí)HCN4?MSCs中有HCN4mRNA的表達(dá)；膜片鉗記錄到HCN4?MSCs上有時(shí)間和電壓依賴性的超極化激活的內(nèi)向電流，該電流的激活閾電壓為-70mV，對(duì)低濃度C

8、S?敏感，符合If的特征。至此說明，MSCs上已經(jīng)成功表達(dá)有起搏離子通道HCN4。
　　 3)將HCN4?MSCs與3d心肌細(xì)胞共培養(yǎng)2-4d后，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組心肌細(xì)胞的自發(fā)搏動(dòng)頻率明顯快于“HCN4?MSCs對(duì)照組”中的心肌細(xì)胞自發(fā)搏動(dòng)頻率。膜片鉗結(jié)果顯示心肌細(xì)胞的自發(fā)動(dòng)作電位頻率顯著提高(129±11次/分vs.82±8次/分，P<0.05，n=5)；動(dòng)作電位頻率變規(guī)則；動(dòng)作電位最大舒張電位(MDP)絕對(duì)值降低（-66±6mV

9、vs.-87±4mV，P　　 4)PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳以及基因測(cè)序證實(shí)了CX45(

10、Gja7)基因成功插入表達(dá)載體pDsRED2-N1-RFP中，形成包含CX45基因的質(zhì)粒pDsRED2-N1-RFP/Gja7。脂質(zhì)體2000介導(dǎo)pDsRED2-N1-RFP/CX45瞬時(shí)轉(zhuǎn)染MSCs48小時(shí)后，熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)陽性率達(dá)到60％；經(jīng)過50 ug/ml G418篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)CX45基因的MSCs細(xì)胞株CX45?MSCs。RT-PCT證實(shí)CX45?MSCs上有CX45 mRNA的表達(dá)；免疫雙標(biāo)檢測(cè)到CX45?MSCs

11、細(xì)胞膜上同時(shí)表達(dá)有CX45和CX43。至此說明，CX45基因已經(jīng)改變了MSCs細(xì)胞膜上連接蛋白分布，形成了一種細(xì)胞膜上同時(shí)高表達(dá)CX45和CX43的細(xì)胞株。
　　 5)將HCN4基因轉(zhuǎn)染CX45?MSCs，與心肌細(xì)胞共培養(yǎng)，構(gòu)建新的生物起搏器模型中心肌細(xì)胞的自發(fā)動(dòng)作電位頻率顯著高于“HCN4?CX45?MSCs對(duì)照組”(147±9次/分vs.123±8次/分，P<0.05)；動(dòng)作電位4相自動(dòng)去極化速度(VDD)也明顯提高(0.0

12、65±0.016V/s vs.0.021±0.009 V/s，P<0.05)。免疫雙標(biāo)證實(shí)心肌細(xì)胞與CX45?MSCs相接觸部位有CX43與CX45的表達(dá)。加入甘珀酸后，實(shí)驗(yàn)組和“HCN4?CX45?MSCs”心肌細(xì)胞的自發(fā)搏動(dòng)頻率均明顯降低，實(shí)驗(yàn)組尤其明顯。綜上，MSCs細(xì)胞膜上CX45的高表達(dá)，使得生物起搏器模型的自律性提高。
　　 結(jié)論：HCN4基因改造的MSCs與心室肌細(xì)胞共培養(yǎng)，成功構(gòu)建成具有自律性的心臟生物起搏器模型