自體起搏細(xì)胞移植構(gòu)建生物心臟起搏器的實驗研究.pdf

1、目的： 生物心臟起搏器(Biological Cardiac Pacemaker)是心臟起搏治療領(lǐng)域的未來發(fā)展方向。其原理是利用細(xì)胞技術(shù)與基因治療技術(shù),將起搏基因?qū)敕瞧鸩?xì)胞,構(gòu)建一種“人造”的起搏細(xì)胞,然后植入體內(nèi)使其發(fā)揮其起搏心室提高心率的作用。擬通過生物心臟起搏器的構(gòu)建,探索治療緩慢型心律失常類疾病的新方法,以克服電子心臟起搏器的缺點,最終達到使此類患者免除電子心臟起搏器植入的目的。 本課題在我單位對骨髓干細(xì)胞的

2、長期研究基礎(chǔ)上,結(jié)合國內(nèi)外關(guān)于生物起搏研究的最新進展,分以下3個階段對自體生物心臟起搏器的構(gòu)建進行探索。 1.明確細(xì)胞移植技術(shù)構(gòu)建自體生物心臟起搏的可行性：應(yīng)用犬竇房結(jié)細(xì)胞進行自體心室肌內(nèi)移植,探索自體起搏細(xì)胞移植治療緩慢型心律失常類疾病的作用和效果,為后續(xù)實驗摸索和建立相關(guān)技術(shù)、實驗條件以及評價方法,并提供可行性分析； 2.構(gòu)建自體起搏細(xì)胞：利用攜帶hHCN2基因的重組腺病毒載體(Ad.hHCN2),將hHCN2基因?qū)?/p>

3、入犬骨髓干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)以構(gòu)建具有生理性起搏功能的起搏細(xì)胞(Ad.hHCN2-MSCs); 3.研究自體起搏細(xì)胞體內(nèi)移植起搏心室的效果：將構(gòu)建好的起搏細(xì)胞(Ad.hHCN2-MSCs),通過細(xì)胞移植技術(shù)移植到完全性房室傳導(dǎo)阻滯后的犬自體心室肌內(nèi),構(gòu)建自體生物心臟起搏器,評價其起搏心室的作用和效果。 方法： 1.手術(shù)獲取竇房結(jié)后,通過多種酶的聯(lián)合消化技術(shù)分離獲得竇房結(jié)

4、細(xì)胞,選擇單個自主搏動的竇房結(jié)細(xì)胞進行膜片鉗研究,研究其起搏電流、動作電位等電生理學(xué)參數(shù)。 2.將竇房結(jié)細(xì)胞懸液斜行注入鈦夾標(biāo)記處右心室前壁心外膜下,并在該處心外膜進行標(biāo)記。 3.細(xì)胞移植后兩周后,射頻消融希氏束或房室結(jié)建立完全性房室傳導(dǎo)阻滯動物模型,并通過心臟電生理檢查、移植部位的細(xì)胞學(xué)檢查、免疫熒光染色等技術(shù)和方法,對竇房結(jié)細(xì)胞自體移植后起搏心室的效果進行評價。 4.通過構(gòu)建Ad.hHCN2重組腺病毒,將hH

5、CN2基因?qū)肴撬韪杉?xì)胞(MSCs)。待其在MSCs穩(wěn)定表達后,利用膜片鉗技術(shù)對表達HCN2通道蛋白的MSCs進行電生理學(xué)研究,評價其起搏功能,并進一步優(yōu)化基因轉(zhuǎn)染方法。通過MSCs與乳鼠心肌細(xì)胞的體外聯(lián)合培養(yǎng),研究構(gòu)建的起搏細(xì)胞在體外對心肌細(xì)胞的起搏效果。 5.建立完全性房室傳導(dǎo)阻滯的犬模型,然后將體外構(gòu)建好的自體起搏細(xì)胞(Ad.hHCN2轉(zhuǎn)染的犬骨髓干細(xì)胞)自體移植到心室肌內(nèi),通過采用體表心電圖、24小時動態(tài)心電圖、組織病

6、理學(xué)技術(shù)、免疫熒光組織化學(xué)染色等多種檢測手段綜合評價其起搏心室的作用和效果,并研究這種生物起搏心律對于神經(jīng)體液調(diào)節(jié)的反應(yīng)能力。 結(jié)果： 1.酶消化法分離獲得的犬竇房結(jié)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能保持完整,能夠產(chǎn)生典型的起搏電流,并在體外自主搏動。 2.將分離獲得的竇房結(jié)細(xì)胞自體移植到完全性房室傳導(dǎo)阻滯后的心室肌內(nèi),能夠有效起搏心室,經(jīng)神經(jīng)遞質(zhì)反應(yīng)性研究證實,這種異位起搏心律對異丙腎上腺素具有良好的反應(yīng)性。 3.對細(xì)胞移

7、植部位的心室肌標(biāo)本進行分離,證實移植的竇房結(jié)細(xì)胞能夠在移植部位存活,同時也與心室肌細(xì)胞形成了功能性的縫隙連接結(jié)構(gòu)。免疫組織化學(xué)研究進一步證實,移植細(xì)胞之間以及移植細(xì)胞與原有心室肌細(xì)胞之間均有縫隙連接蛋白表達,提示細(xì)胞間形成了電-機械耦聯(lián)。 4.Ad.hHCN2轉(zhuǎn)染犬骨髓干細(xì)胞后,其轉(zhuǎn)染效率約為70％,細(xì)胞狀態(tài)良好。對轉(zhuǎn)染后的MSCs進行膜片鉗研究,可以記錄到具有超極化電壓激活以及時間依賴性特點的起搏電流,并且這種電流隨電壓的遞增

8、而不斷增強,在超極化鉗制電壓為-105mV時完全激活,峰電流強度約為-400 pA,并具有起搏電流的典型特性。與乳鼠心肌細(xì)胞的體外聯(lián)合培養(yǎng)實驗表明,我們構(gòu)建的起搏細(xì)胞能夠提高乳鼠心肌細(xì)胞的搏動頻率,表明其在體外環(huán)境下具有起搏功能。 5.自體起搏細(xì)胞體內(nèi)移植后第2周起,體表心電圖檢查提示移植組犬出現(xiàn)起源于細(xì)胞移植部位的室性自主心律。心室超速起搏實驗提示實驗組犬的室性自主心律的激動點比對照組具有更高的興奮性。24小時動態(tài)心電圖監(jiān)測表

9、明,從第2周起無突發(fā)或嚴(yán)重的心律不齊或紊亂。利用Holter計算機軟件分析所得的實驗組犬的平均心率、總心搏次數(shù)、生物起搏次數(shù)及生物起搏率等參數(shù)均優(yōu)于對照組,并且這種心律對腎上腺素具有良好的反應(yīng)性。免疫熒光組織化學(xué)研究提示自體移植的MSCs細(xì)胞能夠在移植部位存活,并有效表達HCN2通道蛋白。 結(jié)論： 1、通過體外消化分離得到的竇房結(jié)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能保持完整,且移植到自體心室肌后,能有效提高心室率,并對神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)節(jié)具有良好反

10、應(yīng)性。 2、利用基因技術(shù)構(gòu)建攜帶起搏基因的重組腺病毒載體,轉(zhuǎn)染體外傳代培養(yǎng)的骨髓干細(xì)胞后,經(jīng)膜片鉗技術(shù)和細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)實驗證實這種構(gòu)建的起搏細(xì)胞在體外環(huán)境下具有起搏功能。 3、將構(gòu)建好的起搏細(xì)胞自體移植到完全性房室傳導(dǎo)阻滯犬心室肌后,能有效起搏心室并提高室性節(jié)律,發(fā)揮其作為生物心臟起搏器的作用,并且這種生物起搏心律具有良好的自動調(diào)節(jié)能力。 4、自體生物心臟起搏器雖然能夠提高完全性房室傳導(dǎo)阻滯后的心室率,但這種生物起