一種能同時檢測金黃色葡萄球菌A型和B型腸毒素單克隆抗體的制備及特性分析.pdf

1、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一種重要的人畜共患致病菌,廣泛存在于自然界中,其產(chǎn)生的腸毒素(staphylococcal enterotoxins,SE)可通過污染食物而導(dǎo)致食物中毒。目前,隨著人們對食品安全重視度的加深,國際上已將腸毒素的檢測列入食品檢驗法規(guī),因此建立靈敏、快速的腸毒素檢測方法,是食品安全檢測的一項重要研究內(nèi)容。
　　 腸毒素的檢測方法主要有動物學(xué)試驗、免疫學(xué)方法、分子生物學(xué)方法

2、、生物傳感器技術(shù)和超抗原技術(shù)。在這些方法中,免疫學(xué)方法因其具有簡便、快速、靈敏、特異性高等特點,是檢測腸毒素廣泛采用的一項技術(shù)。單克隆抗體(monoclonalanibody,McAb)純度高,特異性強,一經(jīng)研制出,便可大批量生產(chǎn),將其用于腸毒素的免疫學(xué)檢測將大大提高檢測的特異性和靈敏度。商品化腸毒素ELISA檢測試劑盒中采用的單克隆抗體主要是通過細胞融合技術(shù),對實驗動物單獨免疫一種抗原所產(chǎn)生的單抗,一次實驗只能檢測一種腸毒素。已知腸毒

3、素種類多達20種,葡萄球菌食物中毒往往也不是由單一腸毒素引起的,在實際檢測過程中,有時不需要對腸毒素血清型作出鑒定,只要判斷有沒有腸毒素存在即可,因此如果一次反應(yīng)能同時檢測多種腸毒素將大大減少葡萄球菌食物中毒分析的工作量。為此,采用混合免疫法,篩選制備能同時針對多種腸毒素抗原的共同決定簇的單克隆抗體,有可能實現(xiàn)一次反應(yīng)檢測多種腸毒素。
　　 本課題以引起葡萄球菌食物中毒比較常見的金黃色葡萄球菌A型和B型腸毒素(staphyloc

4、occal enterotoxin A,SEA和staphylococcal enterotoxin B,SEB)作為免疫原,采用混合免疫方法,運用雜交瘤技術(shù)制備得到同時針對SEA和SEB的單克隆抗體；同時以SEA單獨免疫BALB/c小鼠為對照,經(jīng)同樣的方法,制備得到相應(yīng)的抗SEA單克隆抗體。對兩種免疫方法制備的單克隆抗體的性質(zhì)進行了一系列的分析和比較,并采用間接競爭ELISA對混合免疫制備的單抗在金黃色葡萄球菌腸毒素污染的乳制品中腸毒

5、素的檢測進行了初步的應(yīng)用評價。主要研究結(jié)果如下:
　　 1抗SEA-SEB多克隆抗體的制備及ELISA分析
　　 采用SEA和SEB兩種抗原等量混合免疫BALB/c小鼠(編號1～3),免疫劑量為20μg次/只(SEA和SEB各10μg),在每次免疫后的第7 d進行采血,得到抗血清。間接ELISA實驗分析表明,免疫小鼠從第21 d開始有明顯抗體產(chǎn)生,第49 d抗體的效價達到較高水平,其中2號小鼠第四次免疫后的抗血清針對SE

6、A的效價為4.5×104,針對SEB的效價為5.0×104；抗血清對SEA的靈敏度為81.3 ng/mL,對SEB的靈敏度為62.4 ng/mL?？寡鍖EA和SEB都有很強的特異性,與金黃色葡萄球菌C1型腸毒素(SEC1)、牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)均無交叉反應(yīng)。
　　 同時,采用SEA單獨免疫BALB/c小鼠(編號4～6),免疫劑量為10μg/次/只,免疫小鼠從第21 d開始有明顯抗體產(chǎn)生,第49 d抗體

7、的效價達到較高水平,其中4號小鼠第四次免疫后的抗血清針對SEA的效價為5.0×104；抗血清對SEA的靈敏度為73.9 ng/mL?？寡鍖EA有很強的特異性,與SEB、SEC1、BSA和OVA均無交叉反應(yīng)。
　　 2抗SEA-SEB單克隆抗體的制備及性質(zhì)分析
　　 采用SEA和SEB混合免疫的2號小鼠,取其脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞進行融合,經(jīng)間接ELISA篩選和有限稀釋法亞克隆,獲得1株能同時分泌抗SEA和SEB

8、的雜交瘤細胞3F2。采用SEA單獨免疫的4號小鼠,經(jīng)同樣的方法,獲得1株分泌抗SEA的雜交瘤細胞3C12。
　　 將2株雜交瘤細胞分別注射于BALB/c小鼠體內(nèi)生產(chǎn)腹水抗體,用間接ELISA方法對收集到的抗體的效價、靈敏度、特異性、親和力、雜交瘤細胞的染色體數(shù)目和分泌抗體的穩(wěn)定性等性質(zhì)進行了一系列的分析。結(jié)果表明,雜交瘤細胞3F2所產(chǎn)腹水抗體針對SEA的效價為4×105,靈敏度為133.2 ng/mL,親和力常數(shù)為8.18×10

9、7L/mol;針對SEB的效價為1×105,靈敏度為82.5 ng/mL,親和力常數(shù)為5.32x107L/mol,與SEC1、BSA、OVA等均無交叉反應(yīng)。雜交瘤細胞3C12所產(chǎn)腹水抗體針對SEA的效價為2×105,靈敏度為115.9 ng/mL,親和力常數(shù)為6.76×107L/mol,與SEC1、BSA、OVA等均無交叉反應(yīng),與SEB僅有很微弱的交叉反應(yīng)。
　　 通過對兩株雜交瘤細胞的染色體數(shù)目分析表明,雜交瘤細胞3F2和3C

10、12的染色體數(shù)都在100條左右,近似等于兩親本細胞染色體數(shù)目之和,說明得到的雜交瘤細胞是親本細胞的融合。2株雜交瘤細胞經(jīng)連續(xù)傳代6周和三個月的反復(fù)凍融后,分泌抗體的能力及效價水平變化不大,表明這兩株雜交瘤細胞株比較穩(wěn)定。
　　 3抗SEA-SEB單克隆抗體在乳制品檢測中的初步應(yīng)用
　　 選取易受腸毒素污染的乳制品(牛奶和酸奶)為研究對象,對混合免疫制備的單抗3F2在腸毒素檢測中的應(yīng)用效果進行了評價。(1)將單一腸毒素SE

11、A或SEB添加到不含腸毒素的牛奶樣品中,分別用單抗3F2、單抗3C12作為檢測抗體,采用間接競爭ELISA法對樣品中腸毒素的回收率進行了測定。3F2對SEA和SEB都有較好的回收率,對SEA的平均回收率在88.3％～103.5％之間,對SEB的平均回收率在86.2％～101.6％之間；3C12對SEA的平均回收率在86.7％～98.1％之間。(2)將三種不同型別的腸毒素(SEA、SEB和SEC1)進行組合,分別添加到不含腸毒素的牛奶樣品