誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對結(jié)締組織相關(guān)性肺間質(zhì)纖維化的治療機(jī)制.pdf

1、研究背景和目的：
　　間質(zhì)性肺疾病(ILD，Interstitial lung Disease)，是一組累及肺間質(zhì)，肺泡，有時也累及細(xì)支氣管的一種肺部彌漫性病變，其病因復(fù)雜，預(yù)后也不盡相同，由于目前尚無確切有效的治療途徑，故臨床上伴隨著很高的病死率。結(jié)締組織病是引起ILD最主要的原因，而ILD則是導(dǎo)致結(jié)締組織疾病患者死亡的主要并發(fā)疾病之一。CTD和CTD-ILD的發(fā)病機(jī)制目前仍不是很清楚，局部和全身的免疫系統(tǒng)激活和免疫耐受受損在C

2、TD和ILD中普遍存在，T細(xì)胞免疫功能的過度激活和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）數(shù)量和功能缺失可能在CTD和CTD-ILD發(fā)病中具有重要的地位，因此，恢復(fù)機(jī)體正常的免疫調(diào)節(jié)應(yīng)該是治療這一類疾病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。Treg特有的免疫調(diào)節(jié)活性提示了體外誘導(dǎo)擴(kuò)增 Treg在未來治療中的價值。本研究以CTD-ILD和RA為代表的CTD患者為研究對象，旨在深入探討CTD-ILD免疫失衡的發(fā)病機(jī)制，在此基礎(chǔ)上，研究體外誘導(dǎo)擴(kuò)增 Tregs的細(xì)胞治療方式用于CTD

3、-ILD的可行性和機(jī)制。
　　研究內(nèi)容和方法：
　　第一部分：結(jié)締組織相關(guān)性肺間質(zhì)纖維化的免疫病理特點
　　收集了28例CTD-ILD、14例RA急性發(fā)作期和緩解期，以及23例健康正常對照者外周抗凝血標(biāo)本，進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)檢測，觀察CD3+CD4+，CD3+CD8+，CD3+CD56+，CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞亞群比例變化，CD4+IFN-γ+Th1細(xì)胞，CD4+IL-4+Th2細(xì)胞，和CD4+ IL-17+T

4、h17細(xì)胞的比例；并用Elisa與液相芯片方法檢測了血漿細(xì)胞因子TNF-α，IFN-γ，和IL-17的水平。其中6例同時進(jìn)行病理活檢的肺組織標(biāo)本進(jìn)行HE、MASSON染色，CD3和α-SMA免疫組化染色，觀察患者肺組織病理表現(xiàn)和淋巴細(xì)胞浸潤情況。同時收集了6例CTD-ILD患者的肺泡灌洗液標(biāo)本，對其CD3+，CD3+CD4+，CD3+CD8+，CD3+CD56+比例進(jìn)行檢測。
　　第二部分：體外誘導(dǎo)CD4+CD25+Foxp3+調(diào)

5、節(jié)性T細(xì)胞
　　分別通過兩種不同的方法體外擴(kuò)增誘導(dǎo) CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞：①采納已報道的實驗室研究方法：首先采納磁珠分選儀與包被有相關(guān)單克隆抗體的磁珠將外周血PBMCs中的CD4+的T細(xì)胞進(jìn)行分選，在分選出的CD4+的T細(xì)胞中加入Rh-IL-2（50U/ml），CD3單抗（2ug/ml），CD28單抗（2ug/ml），人TGF-β1細(xì)胞因子（5ng/ml），和二巰基乙醇，全反式維甲酸，進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)得到CD4+

6、iTreg。②采納本研究改良的方法：先通過分離出貼壁細(xì)胞的方法處理細(xì)胞，再加入上述細(xì)胞因子進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)得到iTreg。比較兩種方法誘導(dǎo)Treg的純度，細(xì)胞增殖情況，并通過與標(biāo)記了CFSE的PBMCs進(jìn)行共培養(yǎng)，觀察 iTreg對PBMCs增殖的抑制作用。
　　第三部分：iTreg對體外誘導(dǎo)NKT-PBMCs的調(diào)節(jié)作用
　　分離健康正常人外周血PBMCs，加入IFN-γ,IL-2，和CD3單克隆抗體，進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)得到含有高比例

7、CD3+CD8+和CD3+CD56+的細(xì)胞群（NKT-PBMCs），分析NKT-PBMCs，純化CD4+體外誘導(dǎo)的iTreg和未純化體外誘導(dǎo)的iTreg三種細(xì)胞培養(yǎng)上清細(xì)胞因子的分泌情況，用液相芯片的方法檢測了TNF-α，IFN-γ，IL-10，IL-8，MCP-1和TGF-β1的水平。之后將 NKT-PBMCs分別與上述兩種iTreg以transwell的方式進(jìn)行共培養(yǎng)孵育，觀察iTreg對NKT-PBMCs細(xì)胞亞群的調(diào)節(jié)作用，實驗分

8、為NKT-PBMCs對照組，iTreg（PBMCs）共培養(yǎng)組和CD4+iTreg共培養(yǎng)組。最后用液相芯片的方法檢測了iTreg對NKT-PBMCs分泌TNF-α，IFN-γ，IL-10，IL-8，MCP-1和TGF-β1的調(diào)節(jié)作用。
　　第四部分：iTreg對患者外周血PBMCs的調(diào)節(jié)作用
　　分別收集了5例RA患者急性發(fā)作期和2例CTD-ILD患者外周血標(biāo)本，分離PBMCs，將患者PBMCs與iTreg進(jìn)行共培養(yǎng)，觀察iT

9、reg對患者PBMCs細(xì)胞亞群的調(diào)節(jié)作用，實驗分為PBMCs對照組，iTreg（PBMCs）共培養(yǎng)組和CD4+iTreg共培養(yǎng)組。最后用液相芯片的方法檢測了iTreg對患者 PBMCs分泌 TNF-α，IFN-γ，IL-6，IL-10和IL-17的調(diào)節(jié)作用。
　　結(jié)果：
　　第一部分：結(jié)締組織相關(guān)性肺間質(zhì)纖維化的免疫病理特點
　　研究發(fā)現(xiàn)在患者肺組織中，存在著炎癥細(xì)胞的浸潤，主要是以CD3+的T淋巴細(xì)胞為主。并且伴隨著

10、肺泡上皮細(xì)胞破壞、膠原沉積以及表達(dá)α-SMA的肌纖維母細(xì)胞增多與血管重構(gòu)。患者肺泡灌洗液流式細(xì)胞檢測分析發(fā)現(xiàn)，肺泡灌洗液的細(xì)胞明顯增多，CD3+的T細(xì)胞占CD45+細(xì)胞的90.1％±3.43%，其中，以CD3+CD8+T細(xì)胞為主，CD3+CD56+的NKT細(xì)胞占CD45+細(xì)胞的18.70%±7.04%。在外周血，RA患者急性發(fā)作期間 CD3+T淋巴細(xì)胞較正常對照組明顯升高，且無論是CD3+CD4+的T細(xì)胞（P=0.029），CD3+CD

11、56+NKT細(xì)胞（P=0.000），還是CD3+CD8+的T細(xì)胞都明顯升高（P=0.034），伴隨著CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的減少（P=0.000）。在RA患者緩解期，上述異常升高或下降的指標(biāo)都趨向正常。對28例CTD-ILD患者的外周血進(jìn)行流式細(xì)胞檢測發(fā)現(xiàn)與RA患者外周血類似的結(jié)果，CD3+CD8+的T細(xì)胞（P=0.048），CD3+CD56+NKT細(xì)胞（P=0.003），較正常對照組都明顯升高，伴隨著 CD4+CD

12、25+Foxp3+調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞（P=0.035），和CD3+CD4+的T細(xì)胞的明顯減少（P=0.046）。對其中10例正常對照組和9例CTD-ILD患者的外周血，進(jìn)行流式細(xì)胞檢測Th1，Th2,和Th17細(xì)胞比例，發(fā)現(xiàn)，在CTD-ILD患者體內(nèi)，Th1比例升高（P=0.04），而Th2降低（P=0.000），Th17雖無統(tǒng)計學(xué)差異，但發(fā)現(xiàn)Th17在CTD-ILD患者也有升高趨勢（正常對照組2.17±0.41 vsCTD-ILD患者組2

13、.93±1.41，P=0.15）。CTD-ILD患者血漿標(biāo)本TNF-α，IFN-γ，和IL-17三種細(xì)胞因子的水平較正常對照組明顯增加，且差別均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　第二部分：體外誘導(dǎo)CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞
　　采用兩種方法誘導(dǎo)iTreg，分別為傳統(tǒng)方法（CD4+iTreg組）和不經(jīng)過分選直接誘導(dǎo)的改良新方法（iTreg組），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，iTreg組誘導(dǎo)的細(xì)胞具有更好的增殖能力（P＜0.05

14、）。另外我們對培養(yǎng)體系進(jìn)行流式細(xì)胞檢測鑒定，發(fā)現(xiàn)雖然CD4+T細(xì)胞在CD4+iTreg組的比例較未分選組明顯增加(P＜0.01)，但CD4+CD25+細(xì)胞(P>0.05)和CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞(P>0.05)所占比例兩種培養(yǎng)方式并無差別。通過對PBMCs的抑制實驗，發(fā)現(xiàn)兩種誘導(dǎo)的細(xì)胞都可以有效抑制PBMC增殖，且兩組之間的抑制活力并無明顯差別。
　　第三部分：iTreg對體外誘導(dǎo)NKT細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用
　　通過對

15、正常人外周血PBMCs的誘導(dǎo)，得到含有CD3+CD8+和CD3+CD56+的細(xì)胞（NKT-PBMCs）。對NKT-PBMCs的抑制實驗發(fā)現(xiàn)兩種誘導(dǎo)的iTreg細(xì)胞都可以有效抑制NKT-PBMC增殖（P＜0.05）。NKT-PBMCs分別和CD4+iTreg或iTreg進(jìn)行共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)兩種方法誘導(dǎo)的Treg均有下調(diào)NKT-PBMCs中NKT細(xì)胞比例的作用。另外，我們對CD4+iTreg，iTreg和NKT-PBMCs的培養(yǎng)上清進(jìn)行多種細(xì)胞因

16、子的檢測發(fā)現(xiàn)：NKT分泌以TNF-α和IFN-γ為主的細(xì)胞因子，而Treg分泌以IL-10和TGF-β1為主的細(xì)胞因子。且兩種方法誘導(dǎo)的Treg細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子之間比較無明顯差別。與 CD4+iTreg或 iTreg進(jìn)行共培養(yǎng)，可以下調(diào)NKT-PBMCs的培養(yǎng)上清TNF-α和IFN-γ的分泌量，上調(diào)TGF-β1的分泌量（P＜0.05）。另外，與CD4+iTreg或iTreg共培養(yǎng)后的NKT-PBMCs對16HBE細(xì)胞的殺傷活性也降低（

17、P＜0.05）。
　　第四部分：iTreg對患者外周血PBMCs的調(diào)節(jié)作用
　　分別將5名RA患者和2名CTD-IP患者的PBMCs，與兩種iTreg共培養(yǎng)，然后對各組進(jìn)行流式細(xì)胞檢測，發(fā)現(xiàn)與 PBMCs對照組相比，共培養(yǎng)組CD3+CD4+T細(xì)胞（P＜0.05)和CD3+CD8+T細(xì)胞（P＜0.05)和CD3+CD56+細(xì)胞（P＜0.05)比例下降。而 CD4+CD25+Foxp3+的Treg細(xì)胞占 CD4+的比例上升（P＜

18、0.05)，且兩共培養(yǎng)組之間無明顯差別(P?0.05)?；颊逷BMCs在與iTreg細(xì)胞共培養(yǎng)后，細(xì)胞因子TNF-α，IFN-γ，IL-6，（P＜0.05)和IL-17的分泌均降低，而IL-10的分泌升高（P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1. T淋巴細(xì)胞，尤其是CD8+T細(xì)胞和CD3+CD56+的NKT細(xì)胞在RA和CTD-ILD的發(fā)病與急性加重中起著重要的作用，參與了肺損傷與纖維化。Th1/Th2的平衡向Th1漂移,呈現(xiàn)T

19、h1細(xì)胞因子的過度激活，伴有Th17細(xì)胞的顯著增加。
　　2. Treg細(xì)胞數(shù)量受限，免疫調(diào)節(jié)功能缺失也是RA和CTD-ILD發(fā)病過程中的重要環(huán)節(jié)。
　　3.不經(jīng)分選直接體外誘導(dǎo)方法可以得到高純度的具有抑制活性的Treg。提示改良的Treg體外培養(yǎng)法更具臨床標(biāo)準(zhǔn)化推廣用于RA或CTD-ILD治療的潛能。
　　4. iTreg對于包括NKT細(xì)胞在內(nèi)的多種T淋巴細(xì)胞亞群具有免疫調(diào)節(jié)作用，能夠降低PBMCs中高比例的NKT細(xì)