環(huán)孢素A治療博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺間質(zhì)纖維化及其機(jī)制的研究.pdf

1、背景：
　　間質(zhì)性肺病(interstitial lung disease，ILD或DILD，diffuse interstitial lung disease)是以彌漫性肺實(shí)質(zhì)、肺泡炎癥和間質(zhì)纖維化為基本病理病變，以活動(dòng)性呼吸困難、X線胸片彌漫性浸潤(rùn)陰影、限制性通氣障礙、彌散功能(肺一氧化碳彌散量，DLCO)降低和低氧血癥為臨床表現(xiàn)的一類疾病。ILD中一部分患者繼發(fā)于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性硬化癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多肌炎/皮肌炎、強(qiáng)

2、直性脊柱炎及混合結(jié)締組織病，臨床上也很常見(jiàn)。間質(zhì)纖維化一旦形成，將不可逆地導(dǎo)致嚴(yán)重的甚至威脅生命的呼吸循環(huán)功能障礙。因此，加深對(duì)肺間質(zhì)纖維化機(jī)制，尤其是對(duì)其病程早期階段的認(rèn)識(shí)，是該病發(fā)病機(jī)制和治療研究亟待解決的問(wèn)題。
　　CD147，又稱為細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子（extracellular matrix metaloproteinase inducer，EMMPRIN），屬于免疫球蛋白超家族，在體內(nèi)廣泛表達(dá)。Cyclophi

3、lin A（CyPA）是存在于多種細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞溶質(zhì)蛋白，CD147的配體，環(huán)孢素A（cyclosporine A，CsA）作用的靶分子。CsA是一種強(qiáng)效的免疫抑制劑，特異作用于淋巴細(xì)胞，臨床用于預(yù)防和治療同種異體器官移植或骨髓移植的排斥反應(yīng)或移植物抗宿主反應(yīng)，也用于經(jīng)其他免疫抑制劑治療無(wú)效的狼瘡腎炎、難治性腎病綜合征等自身免疫性疾病。
　　本研究所以往研究報(bào)道，在炎癥病灶中高表達(dá)CD147分子的配體CyPA可趨化炎細(xì)胞在關(guān)節(jié)病灶中

4、聚集，通過(guò)與CD147相互作用在RA關(guān)節(jié)內(nèi)、外病變的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮重要作用，CsA對(duì)上述病理過(guò)程有抑制作用。為了探明CyPA-CD147在肺間質(zhì)性病變中是否也存在相似的作用和機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)在前期工作的基礎(chǔ)上，建立肺間質(zhì)纖維化小鼠模型，研究其病程中的細(xì)胞與分子基礎(chǔ)，并用CsA進(jìn)行早期干預(yù)治療，初步探討CD147-CyPA在肺間質(zhì)纖維化發(fā)病中的作用。
　　目的：
　　建立肺間質(zhì)纖維化小鼠模型，觀察模型小鼠肺部炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及膠原纖

5、維沉積的病理過(guò)程，探索其細(xì)胞與分子基礎(chǔ)。用CsA治療模型小鼠肺間質(zhì)炎癥及纖維化，探討其可能的機(jī)制。
　　方法和結(jié)果：
　　1、肺間質(zhì)纖維化小鼠模型及研究體系的建立
　　1.1、肺間質(zhì)纖維化小鼠模型的建立
　　雌性，9～11周齡C57BL/6小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表分為3組：模型組（BLM組）、鹽水對(duì)照組（saline組）和空白對(duì)照組（NC組），每組各24只。以5.0mg/kg（濃度2.0mg/ml）建立肺間質(zhì)纖維化小鼠

6、模型，saline組在相同條件下向氣管內(nèi)注入同體積生理鹽水。
　　1.2、檢測(cè)及研究
　　于給藥第4d、7d、14d分批取材，每次每組8只。實(shí)驗(yàn)小鼠均經(jīng)眼球取血法取外周血500μL，肝素鈉抗凝。計(jì)數(shù)白細(xì)胞總數(shù)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+T淋巴細(xì)胞、CD14+單核細(xì)胞和CD19+B淋巴細(xì)胞數(shù)量比例。剪取小鼠左上肺組織塊置100mL/L福爾馬林固定24h，經(jīng)脫水、石蠟包埋后，制作石蠟切片（切片厚度3μm），行HE及Masson染色。

7、采用Ashcroft評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)BLM組小鼠肺組織纖維化情況。細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)BALF細(xì)胞總數(shù)，細(xì)胞涂片行Giemsa染色。
　　1.3、結(jié)果
　　1.3.1、外周血及BALF細(xì)胞分析
　　BLM組小鼠外周血白細(xì)胞總數(shù)明顯升高，在造模后第7d達(dá)高峰，為（10.96±0.35）×109/L，顯著高于同一時(shí)間點(diǎn)saline組（P<0.01）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CD14+單核細(xì)胞在第4～14d的比例均數(shù)分別為5.94％、5.8

8、6％、4.76％，均較saline組顯著增高。CD19+B淋巴細(xì)胞僅在造模第7d、14d較saline組升高明顯。各時(shí)間點(diǎn)NC組與saline組白細(xì)胞計(jì)數(shù)、CD14+單核細(xì)胞及CD19+B淋巴細(xì)胞相比均未見(jiàn)顯著差異。BLM組第4～14d時(shí)BALF細(xì)胞總數(shù)分別為（35.2±10.10）×106/肺、（23.1±15.52）×106/肺和（14.89±1.33）×106/肺，均較同一時(shí)間點(diǎn)saline組顯著升高。細(xì)胞分類計(jì)數(shù)顯示，BLM組B

9、ALF中升高的主要為淋巴細(xì)胞（7d：104.90/HP），至14d時(shí)仍維持在較高水平。其次為單核-巨噬細(xì)胞，中性粒細(xì)胞在早期（4d，7d）升高明顯。各時(shí)間點(diǎn)NC組與saline組BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)、單核-巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞相比均未見(jiàn)顯著差異。
　　1.3.2、肺組織病理觀察
　　肺組織病理觀察顯示，BLM組自實(shí)驗(yàn)第4d開(kāi)始肺泡間隔逐漸增寬，間質(zhì)內(nèi)細(xì)胞浸潤(rùn)逐漸增多，以淋巴細(xì)胞為主，并有單核-巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)

10、。間質(zhì)內(nèi)及小支氣管周圍成纖維細(xì)胞自實(shí)驗(yàn)第7d開(kāi)始聚集逐漸增多，膠原纖維沉積增多，第14d時(shí)見(jiàn)肺組織結(jié)構(gòu)破壞，瘢痕形成。纖維化評(píng)分在第4d時(shí)平均為1.5分，隨著時(shí)間延長(zhǎng)而增加，至第14d時(shí)為6.92分，纖維化明顯。Saline組及NC組各時(shí)間點(diǎn)肺組織均未見(jiàn)明顯炎癥及纖維化改變。
　　2、環(huán)孢素A治療博來(lái)霉素誘導(dǎo)小鼠肺間質(zhì)纖維化的研究
　　2.1、肺間質(zhì)纖維化小鼠模型的建立及治療
　　雌性，9～11周齡C57BL/6小鼠按

11、照隨機(jī)數(shù)字表分為4組：CsA30mg治療組、CsA50mg治療組、治療對(duì)照組（BLM+saline組）和BLM組，每組各24只。以5.0mg/kg（濃度2.0mg/ml）建立肺間質(zhì)纖維化小鼠模型。于造模次日起腹腔注射給藥，治療組用CsA（30mg/kg，50mg/kg），溶于0.15ml生理鹽水中，治療對(duì)照組用同體積的生理鹽水，每日1次。BLM組不予處理。
　　2.2、檢測(cè)及研究
　　于連續(xù)給藥第4d、7d、14d分批取材，

12、每次每組8只。實(shí)驗(yàn)小鼠均經(jīng)眼球取血法取外周血500μL，肝素鈉抗凝。計(jì)數(shù)白細(xì)胞總數(shù)，流式檢測(cè)CD4+T淋巴細(xì)胞、CD14+單核細(xì)胞和CD19+B淋巴細(xì)胞比例。剪取小鼠左上肺組織塊置100mL/L福爾馬林固定24h，經(jīng)脫水、石蠟包埋后，制作石蠟切片（切片厚度3μm），行HE及Masson染色。免疫組化檢測(cè)CD147表達(dá)情況。采用Ashcroft評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)BLM組小鼠肺組織纖維化情況。細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)BALF細(xì)胞總數(shù)，細(xì)胞涂片Giemsa染

13、色。
　　2.3、結(jié)果
　　2.3.1、外周血及BALF細(xì)胞分析
　　CsA治療后，實(shí)驗(yàn)小鼠外周血白細(xì)胞總數(shù)在CsA30mg組為（5.11±0.25）×109/L，CsA50mg組為(5.63±0.34)×109/L，較BLM組（7.07±0.51）×109/L明顯降低（P＜0.01）；CsA治療組各時(shí)間點(diǎn)CD14+單核細(xì)胞百分率均數(shù)顯著降低，以4d時(shí)最為明顯（＜3.2％）；CD19+B淋巴細(xì)胞比例在4d時(shí)變化不明顯，

14、7d、14d時(shí)其百分率均數(shù)分別為39.95％和37.22％，均顯著低于同一時(shí)間點(diǎn)BLM組（53.27％，P＜0.01）。各時(shí)間點(diǎn)BLM組和治療對(duì)照組白細(xì)胞計(jì)數(shù)、CD14+單核細(xì)胞及CD19+B淋巴細(xì)胞百分率均數(shù)相比均未見(jiàn)明顯差異。CsA治療組小鼠BALF總數(shù)在用藥初期即明顯減少，4d時(shí)30mg組BALF細(xì)胞總數(shù)為（4.47±0.88）×105/肺，50mg組為（14.67±0.26）×105/肺，較之BLM組(35.20±1.10)×1

15、06/肺顯著降低（P＜0.01）；CsA治療組各型細(xì)胞數(shù)量亦明顯下降，其中淋巴細(xì)胞下降最為明顯，每高倍鏡視野可見(jiàn)（16.56±6.44，25.29±14.16；vsBLM，P＜0.01），并持續(xù)低水平至第14d（17.44±8.34；10.58±3.61），病變明顯改善。各組間中性粒細(xì)胞的比較在早期（7d、14d）有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。各時(shí)間點(diǎn)BLM組和治療對(duì)照組BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞相比均未見(jiàn)顯著差異。

16、r>　　2.3.2、肺組織病理觀察
　　CsA治療組肺間質(zhì)炎癥明顯減輕，且50mg組治療效果明顯好于30mg組，間質(zhì)內(nèi)及小支氣管周圍未見(jiàn)成纖維細(xì)胞明顯聚集及膠原纖維沉積增多。纖維化評(píng)分均小于2.0，提示肺部纖維化情況改善。治療對(duì)照組肺部可見(jiàn)明顯炎癥及纖維化改變，與BLM組相比無(wú)顯著差異。
　　2.3.3、肺組織CD147的表達(dá)
　　BLM組小鼠肺組織內(nèi)浸潤(rùn)的單核-巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞均高表達(dá)CD147分子，C

17、sA治療組肺內(nèi)表達(dá)CD147的細(xì)胞明顯減少，但兩劑量組間未見(jiàn)明顯差異。
　　結(jié)論：
　　本文成功建立了肺間質(zhì)纖維化小鼠模型及其研究體系，并用CsA進(jìn)行治療研究。證明博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺間質(zhì)纖維化發(fā)病早期表現(xiàn)為全身和肺部大量炎性細(xì)胞聚集，啟動(dòng)了炎癥反應(yīng)，隨著疾病發(fā)展，將導(dǎo)致晚期肺損傷和纖維化的發(fā)生。CsA早期應(yīng)用不僅可抑制炎癥，而且可抑制疾病發(fā)展，其可能的機(jī)制是通過(guò)阻斷CD147-CyPA相互作用，減少淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及單核-