大鼠戊四氮癲癇模型中一氧化氮的作用及其與α細(xì)辛抗癲癇作用的相關(guān)性研究.pdf

1、癲癇是一種常見的神經(jīng)疾病，全世界有近1％的人口受此疾病的困擾?，F(xiàn)有的藥物治療手段仍然不能全面有效的阻止癲癇發(fā)作。在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究有望為發(fā)展新的抗癲癇藥物和新的抗癲癇治療手段提供有前景的戰(zhàn)略方向。
　　中醫(yī)認(rèn)為石菖蒲具有豁痰開竅平癲癇的作用，治癲癇單用有效，α細(xì)辛是石菖蒲上述作用的主要活性成分。雖然α細(xì)辛已經(jīng)在大量研究中表現(xiàn)出抗癲癇作用，但這些研究大多集中于研究體外培養(yǎng)的細(xì)胞或是研究動(dòng)物癲癇發(fā)作的行為學(xué)表現(xiàn)。就我們掌握的資料，關(guān)

2、于α細(xì)辛在體的電生理方面的療效評(píng)估尚存在空白。之前的研究已經(jīng)顯示α細(xì)辛在PTZ模型中表現(xiàn)出抗癲癇作用。本研究將首次嘗試采用在體的電生理監(jiān)測技術(shù)評(píng)價(jià)α細(xì)辛在PTZ誘導(dǎo)的大鼠癲癇模型中的抗癲癇作用效果。α細(xì)辛在體內(nèi)或體外研究中都表現(xiàn)出了抗氧化的作用，α細(xì)辛所具備的還原和抗氧化性質(zhì)可能是其在臨床傳統(tǒng)抗癲癇治療中有益的基礎(chǔ)?；诖它c(diǎn)，本研究還將探索α細(xì)辛表現(xiàn)出的抗癲癇作用是否有NO通路的參與。
　　NO在癲癇發(fā)生發(fā)展的細(xì)胞病理過程中起著非

3、常重要而又復(fù)雜的調(diào)節(jié)作用，已成為一個(gè)研究熱點(diǎn)。關(guān)于NO在癲癇中的作用，已經(jīng)進(jìn)行了大量體外和體內(nèi)的研究，不論在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)還是臨床研究的結(jié)果中均可以看到NO參與了癲癇的發(fā)生發(fā)展，但是得出的結(jié)論仍然是矛盾的，促癲癇和抗癲癇作用均有報(bào)告。NO由精氨酸在一氧化氮合成酶(Nitrieoxidesthase，NOS)的作用下產(chǎn)生，NOS有三種不同亞型nNOS、iNOS及eNOS。人們對(duì)于NO與癲癇關(guān)系的研究，從最初檢測NO水平的變化，逐漸轉(zhuǎn)移至具體研究

4、哪一種NOS引起的NO變化更有意義。現(xiàn)有的研究顯示檢測到的NO和NOS水平缺乏一致性表現(xiàn)，產(chǎn)生不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能與動(dòng)物模型的選擇，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，用藥的途徑，發(fā)作形式不同等有關(guān)，因此仍需作進(jìn)一步詳盡的研究。
　　本研究使用四種NO調(diào)節(jié)劑，包括非選擇性一氧化氮合酶(NOS)抑制劑NG-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME，60mg/kg)、神經(jīng)元型一氧化氮合酶(nNOS)抑制劑7-硝基吲唑（7-NI，40mg/kg）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶

5、(iNOS)抑制劑氨基胍（AG，100mg/kg）和NO前體L-精氨酸(L-ARG，500mg/kg)?？紤]到NO通路可能既參與癲癇模型形成又參與α細(xì)辛抗癲癇作用，故而在藥物干預(yù)和造模的不同階段施與NO調(diào)節(jié)劑，分析不同情況、不同階段三種NOS所起作用，最后綜合分析得出NO與戊四氮癲癇模型及α細(xì)辛抗癲癇作用的關(guān)系。
　　實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分四部分:1、比較兩個(gè)劑量的PTZ(50和60mg/kg)誘發(fā)的癲癇樣腦電活動(dòng)，須滿足皮層腦電記錄2小時(shí)，

6、根據(jù)比較結(jié)果選擇合適的造模劑量用于α細(xì)辛的療效評(píng)估;選定造模劑量后，在PTZ造模后20分鐘給予α細(xì)辛，觀察四個(gè)不同劑量的α細(xì)辛（20，40，60和80 mg/kg）對(duì)PTZ誘發(fā)癲癇放電的作用效果，根據(jù)比較結(jié)果確定α細(xì)辛的劑量。2、在PTZ注入5分鐘后，分別給予四種NO調(diào)節(jié)劑，α細(xì)辛在PTZ給藥20分鐘后腹腔注入，研究NO調(diào)節(jié)劑對(duì)α細(xì)辛抗癲癇作用的影響。3、α細(xì)辛給藥之前15分鐘系統(tǒng)應(yīng)用NO調(diào)節(jié)劑，在α細(xì)辛給藥20分鐘后腹腔注入PTZ，研

7、究NO調(diào)節(jié)劑對(duì)α細(xì)辛預(yù)防癲癇作用的影響。4、造模前15分鐘給予四種NO調(diào)節(jié)劑，PTZ腹腔注入5分鐘后給予α細(xì)辛，研究NO調(diào)節(jié)劑對(duì)癲癇模型及α細(xì)辛抗癲癇作用的影響。
　　結(jié)果:
　　1、兩個(gè)劑量的PTZ在造模后存活時(shí)間、強(qiáng)直陣攣發(fā)作潛伏期、累計(jì)強(qiáng)直陣攣持續(xù)時(shí)間、單次最長強(qiáng)直陣攣持續(xù)時(shí)間和累計(jì)強(qiáng)直陣攣發(fā)作次數(shù)的比較中均無顯著差異。在陣攣潛伏期的比較中，兩組間有顯著性差異(p=0.001)，在PTZ50mg/kg組，陣攣潛伏期為1

8、09.3±41.4秒，在PTZ60 mg/kg組，陣攣潛伏期為49.0±22.8秒。根據(jù)上述分析結(jié)果，在α細(xì)辛的研究中采用PTZ50 mg/kg。α細(xì)辛在60和80mg/kg兩個(gè)劑量時(shí)能顯著減少陣攣放電頻率，60mg/kgα細(xì)辛的抗癲癇作用出現(xiàn)在給藥50分鐘后且持續(xù)不足10分鐘。80mg/kgα細(xì)辛的抗癲癇作用出現(xiàn)在給藥20分鐘后并可持續(xù)達(dá)50分鐘。由此決定，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中α細(xì)辛采用80mg/kg。
　　2、單獨(dú)給予L-NAME或7

9、-NI對(duì)于PTZ模型中的陣攣樣電活動(dòng)和間期放電均無影響，而單獨(dú)使用L-ARG卻能在給藥后最初5分鐘內(nèi)明顯減少間期放電的頻率，AG單獨(dú)給予能明顯增加間期放電的頻率。與α細(xì)辛組相比，L-ARG+α細(xì)辛組中抗陣攣?zhàn)饔锰崆?0分鐘出現(xiàn)。在α細(xì)辛注射15分鐘之前給予L-NAME或7-NI使得α細(xì)辛的抗陣攣?zhàn)饔孟?。L-NAME不僅逆轉(zhuǎn)了α細(xì)辛的抗癲癇作用，甚至使得間期頻率增加;AG也逆轉(zhuǎn)了α細(xì)辛的抗陣攣?zhàn)饔?，但AG對(duì)模型中間期放電的不良作用也被α

10、細(xì)辛的作用抵消。
　　3、在PTZ造模20分鐘前給予α細(xì)辛能明顯抑制陣攣發(fā)作的頻率，持續(xù)可達(dá)30分鐘。α細(xì)辛之前給予L-NAME或7-NI抑制了α細(xì)辛的抗癲癇作用，并且在應(yīng)用L-NAME時(shí)觀察到陣攣頻率顯著增加，這種促癲癇的效果出現(xiàn)在PTZ注入70分鐘后。L-ARG也抑制了α細(xì)辛的抗癲癇作用，并且呈現(xiàn)出雙相作用，在造模初期增加陣攣發(fā)作頻率而在后期卻減少間期放電頻率。AG對(duì)α細(xì)辛的作用無影響。
　　4、7-NI和AG都能明顯增

11、加PTZ誘發(fā)的陣攣發(fā)作，并且7-NI的作用要早于AG的作用。L-NAME和L-ARG對(duì)PTZ誘發(fā)的陣攣樣放電和間期放電均無明顯作用。PTZ后5分鐘給予α細(xì)辛能顯著減少陣攣的平均發(fā)作頻率而對(duì)間期放電無作用，這種抗癲癇效果出現(xiàn)在PTZ注入50分鐘后并持續(xù)30分鐘。α細(xì)辛能夠逆轉(zhuǎn)7-NI和AG在PTZ模型中的促驚厥作用。在L-NAME和L-ARG存在的條件下，α細(xì)辛的抗癲癇作用被抵消。
　　結(jié)論:在PTZ模型中，三種NOS均被激活，但不

12、同NOS合成的NO發(fā)揮的作用不同，eNOS合成的NO發(fā)揮促癲癇作用，nNOS和iNOS合成的NO具有抗癲癇作用，這似乎說明NO并未直接參與癲癇發(fā)生過程，其本身不具有確定的促癲癇或是抗癲癇性能，NO通過作用于不同的受體或位點(diǎn)而啟動(dòng)不同的機(jī)制，最終表現(xiàn)出相似或相反的作用效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示不同NOS在PTZ造模后不同階段被活化，造模5分鐘內(nèi)eNOS迅速被激活，造模5分鐘后nNOS和iNOS逐漸被活化，且nNOS的活化早于iNOS出現(xiàn)，但iNO

13、S的活化持續(xù)時(shí)間更長。在癲癇中各種不同亞型的NOS相互制約、相互協(xié)調(diào)，維持著使機(jī)體最小損傷的微妙平衡。
　　在PTZ造模5分鐘后給予α細(xì)辛?xí)r，α細(xì)辛可能是通過抑制eNOS合成NO而起到抗癲癇作用;在PTZ造模20分鐘后給予α細(xì)辛?xí)r， nNOS及其產(chǎn)生的NO參與了α細(xì)辛在大鼠PTZ癲癇模型中的抗癲癇作用，α細(xì)辛可能是通過誘導(dǎo)nNOS合成NO而起到抗癲癇作用;iNOS未參與α細(xì)辛抗癲癇的作用機(jī)制。在α細(xì)辛的抗癲癇作用中，同時(shí)有促NO合