高效生防菌枯草芽胞桿菌的篩選及其發(fā)酵工藝優(yōu)化.pdf

1、在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中，植物病原真菌和細(xì)菌很易感染植物，每年造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。化學(xué)農(nóng)藥曾經(jīng)在植病防治上發(fā)揮了巨大的作用，但是它引起土壤、水體和大氣的污染，農(nóng)副產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留增加，直接危害了人類的健康及生存，以及病原菌的抗藥性等問題，由此加速了人們?nèi)で笮碌陌踩行У闹参锊『Ψ乐瓮緩?，生物防治便是其中一種有效的防治途徑。 本研究以西瓜枯萎尖鐮胞菌(Fusariumoxysporumf.sp.melonis)為指示菌，通過NA平板初篩，

2、從實(shí)驗(yàn)室保存的482株細(xì)菌中得到了17株可以抑制西瓜枯萎尖鐮胞菌生長的拮抗菌株，抑菌帶寬度達(dá)到8.5～26mm。經(jīng)過多次傳代，保留10株抑菌圈帶寬度穩(wěn)定在10mm以上的拮抗菌株。同時測得其中BS-3、BS-5、BS-17等菌株對多種植物病原真菌有不同程度的抑制作用。溫室盆栽實(shí)驗(yàn)表明，BS-3、BS-5、BS-17對西瓜枯萎病的防病效果分別為25.70％、81.77％和41.27％。在湖北省農(nóng)科院的大田試驗(yàn)重復(fù)測定BS-5對西瓜枯萎病的防

3、病效果，發(fā)現(xiàn)其防病效果達(dá)到了84.58％。由此可見，BS-5對于防治西瓜枯萎病具有良好的效果，有作為生防制劑的潛力。通過形態(tài)和生理生化特征初步鑒定菌株BS-5為枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)，16SrDNA序列分析進(jìn)一步確定該菌株為枯草芽胞桿菌。 通過硫酸銨分級鹽析法對BS-5所產(chǎn)拮抗物質(zhì)進(jìn)行了初步提取，發(fā)現(xiàn)當(dāng)硫酸銨飽和度在40％以下時，沉淀物基本無拮抗活性；硫酸銨飽和度在40％～80％之間，基本可以將拮抗物質(zhì)

4、完全沉淀。在此基礎(chǔ)上，初步研究了拮抗粗提物的理化性質(zhì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BS-5拮抗粗提物經(jīng)100℃處理20min之后的活性可保存70％以上，121℃處理20min后的抑菌活性明顯下降到35.92％；將拮抗粗提物經(jīng)氯仿、無水乙醇、乙腈等有機(jī)溶劑處理后其抑菌活性基本保持不變；而經(jīng)紫外線、蛋白酶和高離子強(qiáng)度處理后抑菌活性保持80％以上；在pH5～8之間活性穩(wěn)定；BS-5拮抗物質(zhì)的茚三酮反應(yīng)呈陰性，酸水解后茚三酮反應(yīng)呈陽性，雙縮脲反應(yīng)也呈陽性。

5、 以金氏培養(yǎng)基為出發(fā)培養(yǎng)基，通過搖瓶發(fā)酵優(yōu)化試驗(yàn)，得到BS-5生長的培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件為：葡萄糖60g/L，豆粕20g/L，酵母粉3g/L，K2HPO4·3H2O1g/L，MgSO4·7H2O0.2g/L；培養(yǎng)溫度30℃，種齡8h，接種量2％，在500mL搖瓶中裝液量為30mL，初始pH7.5，最終生物量達(dá)到6.2×109cfu/mL。在3L發(fā)酵罐中進(jìn)行BS-5發(fā)酵工藝優(yōu)化，將豆粕濃度提高到40g/L，此時生物量可以達(dá)到8.2×