基因突變和基因組

1、基因突變種類癌的遺傳學(xué)基礎(chǔ)人類基因組計劃DNA操作技術(shù),10 基因突變和基因組,基因突變,指一個基因中的DNA改變，最終造成遺傳多樣性,10.1 基因突變種類,堿基對改變(點突變)轉(zhuǎn)座因子,10.1.1 堿基對改變,如果一個基因上原來的一個堿基對被另一個堿基對取代，稱為點突變置換（同義突變、錯義突變、無義突變）插入或缺失（移碼突變）,1、置換,同義突變錯義突變無義突變,同義突變（same sense mutat

2、ion） 堿基被替換之后，產(chǎn)生了新的密碼子，但新舊密碼子同義，所編碼的氨基酸種類保持不變，因此同義突變并不產(chǎn)生突變效應(yīng) 。,,,錯義突變（missense mutation） 堿基替換使編碼某種氨基酸的密碼子變成編碼另一種氨基酸的密碼子，從而使多肽鏈的氨基酸種類和序列發(fā)生改變。,,,,無義突變（non-sense mutation） 堿基替換使編碼氨基酸的密碼變成終止密碼UAA、UAG或UGA。,,,,,T代替G,2、插入或

3、缺失,移碼突變,,,根據(jù)基因突變發(fā)生的原因，可將突變分為：自發(fā)突變和誘發(fā)突變在自然條件下，未經(jīng)人工處理而發(fā)生的突變?yōu)樽园l(fā)突變經(jīng)人工處理而發(fā)生的突變是誘發(fā)突變,3、突變的誘發(fā),誘變劑,能誘發(fā)基因突變的各種內(nèi)外環(huán)境因素統(tǒng)稱為誘變劑（mutagen）物理誘變劑：各種射線等化學(xué)誘變劑,紫外線誘發(fā)的胸腺嘧啶二聚體,T-A T-T,,常見的化學(xué)誘變劑有：,堿基類似物：以假亂真如：5-Bu(酮式與T結(jié)構(gòu)相似，烯醇式與G

4、結(jié)構(gòu)相似)，可以置換T或G丫啶類染料、氮芥類衍生物：造成DNA增加一、二個堿基， 引起移碼突變亞硝酸或烷化劑:可以改變核酸中核苷酸化學(xué)組成,HNO2,10.1.2 轉(zhuǎn)座因子,,30歲那年，麥克林托克在某些玉米籽粒中發(fā)現(xiàn)了玉米色素顯現(xiàn)著一些稀奇古怪的模式。她觀察到玉米籽粒顏色的遺傳很不穩(wěn)定，有時籽粒上還出現(xiàn)一些斑斑點點。她通過耐心的記錄和仔細的分析，發(fā)現(xiàn)使籽粒著色的色素基因是在某一特定代上“接上”或“拉斷”的。,,195

5、1年，在冷泉港生物學(xué)專題討論會上，麥克林托克遞交了自己的學(xué)術(shù)論文，向科學(xué)界同行報告了她的新理論。她提出遺傳基因可以轉(zhuǎn)移，能從染色體的一個位置跳到另一個位置，甚至從一條染色體跳到另一條染色體上。她把這種能自發(fā)轉(zhuǎn)移的遺傳基因稱為“轉(zhuǎn)座因子” 。 “轉(zhuǎn)座因子”除了具有跳動的特性之外，還具有控制其他其因開閉的作用，因此“轉(zhuǎn)座因子”又可叫做“控制因子”。,,巴巴拉·麥克林托克的發(fā)現(xiàn)，當(dāng)時幾乎不被科學(xué)界所接受直到20世紀6

6、0年代末，美國細菌學(xué)家J.Shapiro在研究大腸桿菌乳糖操縱子時發(fā)現(xiàn)，有一類可以移動的因子，會導(dǎo)致基因的插入失活和自主恢復(fù)活性，從而確認了轉(zhuǎn)座因子的存在1983年，巴巴拉·麥克林托克榮獲諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。,真核細胞轉(zhuǎn)座因子分為轉(zhuǎn)座子和逆轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座子是基因中一段DNA序列，它通過自主復(fù)制后成為可移動的、新的轉(zhuǎn)座子拷貝，再插入基因組DNA中逆轉(zhuǎn)座子也是基因中一段DNA序列，它轉(zhuǎn)錄出RNA后，再由反轉(zhuǎn)錄酶最終形成D

7、NA雙鏈，成為新的可移動的逆轉(zhuǎn)座子拷貝，再插入基因組DNA中,,轉(zhuǎn)座插入可引起插入突變、新基因產(chǎn)生及染色體畸變等遺傳學(xué)效應(yīng)基因組中DNA轉(zhuǎn)座不僅可用于解釋染色體缺失、倒位等遺傳現(xiàn)象，而且還可用于構(gòu)建新的突變株,,在幾乎所有物種中都發(fā)現(xiàn)了與轉(zhuǎn)座子相關(guān)的序列如人類中的Alu（阿奴）因子,人的Alu因子約占人基因組10%，由300bp構(gòu)成基本單位，在每個細胞中約有數(shù)十萬拷貝Alu因子比絕大多數(shù)功能性轉(zhuǎn)座因子短得多，不編碼任何蛋白質(zhì)

8、人的DNA中，由于Alu因子轉(zhuǎn)座插入，可導(dǎo)致血友病和家族性高膽固醇血癥等發(fā)生一種罕見的人類神經(jīng)紊亂疾病—腿和腳的肌肉以及神經(jīng)逐漸退化疾病，是由類似果蠅的轉(zhuǎn)座因子Mariner插入17號染色體所致,10.2 脫離正常軌道的細胞—癌細胞,,在動物和人體中，由于細胞分裂調(diào)節(jié)失控而無限增殖的細胞稱為腫瘤細胞惡性腫瘤是指具有轉(zhuǎn)移能力的腫瘤細胞離開原來的部位，擴散到新的組織、器官形成的新的腫瘤,癌細胞的主要特征,能自身提供充足的生長信號

9、對抑制/抗生長信號不敏感能逃避細胞凋亡有無限復(fù)制的潛能能支持癌中新血管生長發(fā)生組織侵染和轉(zhuǎn)移,致癌因子,物理化學(xué)生物,致癌基因,在1911年Rous發(fā)現(xiàn)能使鳥類結(jié)締組織長出腫瘤的病毒，按發(fā)現(xiàn)者的名字命名，為勞氏肉瘤病毒（RSV，發(fā)現(xiàn)者，1879—1970，1966年獲諾貝爾獎）在致癌病毒中找到與致癌直接相關(guān)的基因，稱癌基因，RSV中的癌基因定名為src基因。,src表達產(chǎn)物是酪氨酸激酶，可使細胞中蛋白質(zhì)的酪氨酸磷酸化，

10、使蛋白質(zhì)構(gòu)型和功能改變，從而造成正常細胞癌變進一步研究發(fā)現(xiàn)，未感染的寄主細胞中，用分子雜交技術(shù)也能找到與病毒癌基因相近的核苷酸序列，稱為細胞癌基因（c-src），或原癌基因來自病毒的稱病毒癌基因(v-src),原癌基因如何變成癌基因,轉(zhuǎn)座或易位基因擴增點突變,造成過度表達，或表達產(chǎn)物蛋白質(zhì)活性失控，導(dǎo)致細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化，向癌變方向發(fā)展。,,,腫瘤抑制基因,P53—抑癌基因P53表達產(chǎn)物是與專一性DNA結(jié)合的核蛋白P53是一

11、種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物可通過將細胞阻斷于G1期而抑制細胞生長在某些細胞類型中誘發(fā)細胞凋亡P53基因是人類腫瘤相關(guān)基因中突變頻率最高的基因,10.3 人類基因組計劃（HGP）,1986年，美國Dulbecco在《Science》上發(fā)表的一篇題為“癌癥研究的轉(zhuǎn)折點：人類基因組測序”的短文認為：要弄清癌癥的發(fā)生、演進、侵襲和轉(zhuǎn)移的機制，必須對人的基因組進行全序列測定；并認為這樣大的項目必須通過國際協(xié)作共同完成他的建議很快得到科學(xué)界的贊同

12、和美國有關(guān)部門支持,,1990年正式啟動，預(yù)計15年時間，投資30億美元。美、英、法、德、日、中六國，我國是唯一的發(fā)展中國家，完成1%的測序工作（3號染色體3千萬個堿基對）2000年6月公布草圖，2003年完成。,基因組（genome）： 一個生物體的全部基因序列最簡單的生物如SV40病毒的基因組僅含有5100堿基對（base pair bp）大腸桿菌基因組的大小為5700千堿基對（kbp）人的基因組則由大約3.0&

13、#215;109個bp組成,,在人類基因組中，外顯子僅占1.5%，內(nèi)含子和調(diào)節(jié)序列占25%；基因間DNA間隔占74.5%，其中Alu序列就占10%人類共有2.5萬個基因或更少（原先估計5～10萬）是原核生物平均基因數(shù)的5～15倍人平均基因長度27000bp，而原核生物基因約1000bp,10.4 DNA操作技術(shù),DNA操作技術(shù)是當(dāng)今分子生物學(xué)研究的核心技術(shù)基因工程技術(shù)是DNA操作技術(shù)的一部分,基因工程,采用類似工程技術(shù)的

14、方法，在離體條件下將特定的基因或DNA序列插入載體中，構(gòu)成重組DNA，再把它導(dǎo)入特定的生物細胞中，使外源基因在其中復(fù)制表達，制造出大量基因和基因產(chǎn)物，并改變受體生物的性狀。,過程,1、目的基因的獲得及制?。合拗菩詢?nèi)切酶2 、基因載體的選?。嘿|(zhì)粒、噬菌體3 、DNA體外重組：連接酶4 、DNA重組體導(dǎo)入受體細胞： 大腸桿菌、枯草桿菌、酵母菌5、重組體的篩選6、重組基因的表達,基因工程的內(nèi)容,,基因克隆示意圖,10.4.1

15、目的基因的獲得及制取,1 目的基因獲得,化學(xué)合成法基因組DNA文庫cDNA文庫聚合酶鏈式反應(yīng)PCR,基因組DNA文庫,利用分子克隆的方法，可以把某物種的全部DNA切割成大小合適的片段，并重組到合適的載體中，在合適的受體細胞中擴增，于是人們就可以方便的保存該物種的全部DNA稱為該物種的基因組文庫,cDNA文庫,如果把某組織或細胞中全部的mRNA變成DNA，再克隆到合適的載體上，就得到cDNA文庫。它涵蓋了該組織或細胞中表達

16、的全部基因的編碼序列,DNA多聚鏈式反應(yīng)1985年由美國Millus創(chuàng)立,PCR,基因的 擴增技術(shù)——鏈式擴增反應(yīng),,,變性(94℃),,復(fù)性(55℃),P1,,+,P2,+,,P1,,,,P2,,,合成（72℃）,,,,,PCR,,經(jīng)60次循環(huán)，擴增倍數(shù)為109～1010,操作步驟：,1、加熱變性：將待擴增的DNA置于94～95℃的高溫水浴中加熱5分鐘，使雙鏈DNA解鏈為單鏈DNA，分開的兩條單鏈作為擴增的模板。2、退火：

17、將加熱變性的單鏈DNA溶液的溫度緩慢下降至55℃，在這過程中將引物的堿基與單鏈模板DNA一端堿基互補配對。3、延伸：在退火的過程中，當(dāng)溫度下降至72℃時，在耐熱性TaqDNA多聚酶、適當(dāng)?shù)膒H和一定的離子強度下，引物堿基和模板DNA結(jié)合延伸成雙鏈DNA。,2 制取,將所需的基因從DNA上切割下來，所用的“手術(shù)刀” －－限制性內(nèi)切酶內(nèi)切酶是存在于微生物體內(nèi)具有特異功能的酶類，是微生物作為區(qū)別自己與非己的DNA，近而降解非己的DN

18、A分子的一種防衛(wèi)工具將之提取出來作為基因操作工具。,限制性內(nèi)切酶特點：,種類多極強的特異性，在特定的堿基順序位點上切開，出現(xiàn)兩種末端：,粘性末端 粘端,平頭末端 平端,10.4.2 基因載體的選取,外源基因不易進入宿主細胞，即使進入也難以進行復(fù)制和表達，往往會被宿主細胞的內(nèi)切酶系統(tǒng)降解掉。必須尋找合適的載體，將外源目的基因重組到載體DNA上，組成重組體，再利用載體的生物學(xué)特性導(dǎo)入宿主，完成復(fù)制和表達。,主要載體為：,

19、質(zhì)粒、噬菌體、病毒、細菌人工染色體（BAC）、酵母人工染色體（YAC）不同載體運載外源DNA的大小不同質(zhì)粒載體一般在15kb以下噬菌體可容納25kbBAC可達100～500kbYAC可以插入250～2000kb的DNA片段,細菌、酵母菌和放線菌等生物細胞中染色體以外的雙鏈閉合環(huán)狀分子。大小為1～200kb；能獨立于染色體外進行自我復(fù)制，每個細胞中可含10～200個拷貝。其表型效應(yīng)主要有決定抗藥性，合成抗菌素，編碼限制或修

20、飾酶等,染色體,質(zhì)粒,質(zhì)粒載體,,,,,理想的質(zhì)粒 拷貝數(shù)多; 兩三個抗藥性基因：terr，ampr作為 篩選標志 合適的限制性內(nèi)切酶酶切位點,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,pBR322,Eco RⅠ,Hind Ⅲ,Bam HⅠ,Ava Ⅰ,Pvu Ⅱ,Sal Ⅰ,Pst Ⅰ,O r i,,,EcoR I是從大腸桿菌菌株Eco R RY13中取得的第一種限制酶

21、Hind Ш是從流感嗜血桿菌中取得的第三種限制酶,氨芐青霉素抗性基因,四環(huán)素抗性基因,復(fù)制起點,10.4.3 DNA體外重組,外源基因與載體的連接（DNA連接酶）連接方式：,粘性末端連接 連接效率高平端連接 連接效率低,重組之后的外源DNA還必須回到細胞內(nèi)才能復(fù)制和表達，顯示出生物學(xué)活性?；蚬こ坛Ｓ么竽c桿菌、枯草桿菌、酵母菌為受體菌（宿主）,10.4.4 重組DNA導(dǎo)入受體菌,細菌質(zhì)粒常用的受體細胞是

22、大腸桿菌將外源DNA導(dǎo)入細菌的過程稱為轉(zhuǎn)化細菌只有在一定狀態(tài)下，才可接受外源DNA進入細胞，這種狀態(tài)稱為感受態(tài)受體細胞，如用氯化鈣或用蒸餾水處理后，再加電擊，細菌細胞膜會出現(xiàn)暫時性孔洞，成為能允許帶有外源DNA的載體進入的感受態(tài)細胞重組質(zhì)粒進入受體細胞的概率僅為1‰,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進入受體細胞后，還需要進行篩選鑒定，以挑出含有正確插入外源基因的重組體克隆，摒棄空的載體克隆,10.4.5 重組體的篩選,培養(yǎng)基中加抗生素,培

23、養(yǎng),抗藥性標志選擇,,,由于許多載體的基因組中含有β-半乳糖苷酶基因lacZ，這種載體感染大腸桿菌后，會在大腸桿菌內(nèi)合成β-半乳糖苷酶,IPTG（誘導(dǎo)物）（異丙基硫代- ?-D-半乳糖苷）X-gal（顯色劑）（5-溴-4氯-3-吲哚- ?-D -半乳糖苷）,,形成藍色菌落,如果外源基因插入載體的位置阻斷了β-半乳糖苷酶基因lacZ的編碼序列，則見到無色菌落,10.4.6 克隆基因的表達,表達載體有轉(zhuǎn)錄、翻譯的元件密碼子通用

24、,大腸桿菌表達體系的不足,缺乏轉(zhuǎn)錄后加工機制缺乏翻譯后加工機制，不能折疊和糖基化融合蛋白形成包涵體，復(fù)性后才有活性很難表達大量的可溶性蛋白,10.4.7 轉(zhuǎn)基因動物,將外源基因?qū)氲絼游矬w內(nèi)當(dāng)這種外源基因與動物本身的基因整合后，外源基因就能隨細胞的分裂而增殖在動物體內(nèi)表達出動物原來沒有的性狀并能傳給后代這種動物稱為轉(zhuǎn)基因動物,轉(zhuǎn)基因動物實驗研究方向,1、培育抗逆、優(yōu)質(zhì)的動物新品種如：超級小鼠、抗凍魚、高瘦肉率

25、豬、高產(chǎn)奶牛等,1981年，美國的Brinster和Palmiter用小鼠進行了轉(zhuǎn)基因?qū)嶒炋卮笫笊L激素基因與小鼠的金屬硫蛋白的基因(MT)連在一起，構(gòu)成MTrGH基因然后用顯微注射法注射到小鼠受精卵中再移植入假孕鼠的子宮中，發(fā)育生長共產(chǎn)出21只小鼠其中7只帶外源基因，而6只體型較原小鼠大一倍左右即著名的轉(zhuǎn)基因超級小鼠,2、培育生產(chǎn)藥用蛋白或醫(yī)學(xué)研究模型的轉(zhuǎn)基因動物就基因藥物而言，最理想的的基因表達場所是乳腺，從乳汁中提

26、取的目的基因產(chǎn)物不但產(chǎn)量高且生物活性穩(wěn)定,攜帶人血清白蛋白基因的轉(zhuǎn)基因試管?！疤咸稀?轉(zhuǎn)基因的安全性,如果把一些害蟲趕盡殺絕，田里都是“刀槍不入”的“鐵桿莊稼”是否一定就是好事？人類成千上萬年已吃慣了原有配比的食物，現(xiàn)在為了抗蟲或抗病的目的，把某種細菌的一種對人類十分陌生的蛋白質(zhì)放到作物中去，人類吃后，固然無明顯毒性，長遠來講是否會對人類有傷害？知情權(quán),1、通常PCR反應(yīng)需要（ ）個引物A、1 B、2 C、3

27、 D、42、PCR反應(yīng)（ ）A、由變性、退火、延伸三步循環(huán) B、發(fā)明人是MullisC、所用DNA聚合酶具有很好的耐熱性 D、上述各項3、能夠自我復(fù)制的小型環(huán)狀DNA是（ ）A、轉(zhuǎn)座子 B、移碼子 C、順反子 D、質(zhì)粒,4、和cDNA相比，DNA序列中多出的基因間序列被稱為（） A、操縱子DNA